一株转入红色荧光蛋白的恶臭假单胞菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，特别是一种转入红色荧光蛋白的恶臭假单胞菌及其在促进双孢蘑菇菌丝生长、提高蘑菇产量中的应用。

背景技术：

双孢蘑菇(agaricusbisporus)是世界上栽培最广泛、生产量和消费量最大的一种食用菌，其肉质肥厚、口感鲜美、富含蛋白质、多糖、维生素和不饱和脂肪酸，被誉为“植物肉”，深受国内外消费者喜爱，同时也是我国出口创汇的主要食用菌之一。

双孢蘑菇的正常生长和发育不仅受到各种理化因素诸如温度、湿度、水分,酸碱度、氧气、二氧化碳和光照等的影响,而且也受到生物因子微生物的显著影响。这些微生物存在于培养料和覆土层中。能为蘑菇生长发育提供必要营养,促进其生长发育的微生物称为有益微生物。覆土是双孢蘑菇栽培过程中的一个重要环节，覆土是指在双孢蘑菇培养料表面覆盖一层3-4cm的泥炭或土粒等材料，防止培养料的水分蒸发，稳定培养料的湿度，改善培养料的通气状况，使菌丝由营养生长转入生殖生长，是蘑菇形成子实体的必要条件。研究表明覆土层中的微生物对双孢蘑菇原基的形成起着非常重要的作用，覆土层中的微生物能够去除双孢蘑菇营养生长阶段产生的自我抑制的挥发性物质，从而解除抑制，促进原基形成。因此利用食用菌与有益微生物的互作关系可广开栽培原料,减少辅料用量,提高食用菌生产经济和社会效益。

生防微生物在土壤或宿主中定殖、扩散和生存竞争能力是显示生防作用的重要指标，对提高和稳定菌剂的生防效果、制定科学的施用技术具有重要意义。但是长期以来一直缺乏直观有效的技术手段对其定殖规律及作用机制进行深入的研究，传统的抗生素标记及放射性同位素标记等技术手段难以直观、准确地区分土著微生物和人工接种微生物从而制约了对生防菌作用机制的研究。发光标记系统等现代基因标记技术的兴起为探明拮抗细菌的定殖动态提供了有效的研究手段。目前，未见蘑菇促生菌剂产品相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种转化有红色荧光蛋白的恶臭假单胞菌及其应用，该分离筛选的菌株能够促进双孢蘑菇生长，提高双孢蘑菇产量的细菌菌株，同时通过基因工程手段在菌株中转入红色荧光蛋白，使其便于检测菌株在双孢蘑菇栽培中定殖情况，本发明是这样实现的：

一株恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)，申请人分离筛选了一株能促进双孢蘑菇菌丝生长，提高蘑菇产量的菌株；该菌菌落大小中等，表面湿润，边缘整齐；呈暗红色，革兰氏染色成阳性，形态观察菌体成短杆状，菌体长度1-2μm。测定菌株16srdna部分序列，行进系统发育学分析(菌株的16srdna序列如seqidno.1所示)，因此确定该菌株属于恶臭假单胞菌属(pseudomonasputida)；在此基础上，申请人利用基因工程手段向该菌株中转入红色荧光蛋白，并将获得菌株自命名为tk3rfp。

菌株tk3rfp在lb培养基上肉眼观察到暗红色，lb培养液中30℃摇床过夜培养，取出试管放在260nm紫外灯下观察，菌株有明显的红色荧光出现，对菌体进行革兰染色，放至荧光显微镜下观察，经激发光激发呈现出红色荧光。

申请人于2017年6月29日将菌株tk3rfp保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为：cgmccno.14367。

本发明分离筛选了一株能促进双孢蘑菇菌丝生长，提高蘑菇产量的恶臭假单胞菌，同时为了便于研究该菌株在覆土层中的定殖，利用基因工程手段在该菌株中转入了红色荧光蛋白，便于对该菌在覆土层中的定殖情况检测及对促进双孢蘑菇生长过程的观察；试验证明，菌株tk3rfp能够促进双孢蘑菇菌丝生长，促进原基形成，对于开发蘑菇生长调节剂或生物肥料开发具有开发前景。

附图说明

图1为菌株tk3革兰氏染色显微照片；

图2为菌株tk3电镜照片；

图3为菌株tk3和tk3rfp在lb平板上菌落形态照片；

图4为紫外光激发状态下的tk3和tk3rfp照片；

图5荧光显微镜下tk3rfp成像照片；

图6为菌株tk3rfp与双孢蘑菇在平板共培养条件下菌丝直径的变化照片；

图7为菌株tk3rfp与双孢蘑菇在试管共培养条件下菌丝长度的变化图片。

具体实施方式

实施案例中涉及到的培养基：

lb培养基：酵母粉5g，nacl10g，胰蛋白胨10g，琼脂粉15g，加水定容至1l，调节ph至7.0。

选择性培养基：蔗糖10g，甘油10ml，酪蛋白氨基酸5g，nahco31g，甲氧苄氨嘧啶20mg，mgso4﹒7h2o1g，k2hpo42.3g，sls1.2g，琼脂18g，定容至1l，调节ph至7.0

pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g。称取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1l在锅里煮大约30分钟(能用玻璃棒戳破即可)，然后用8层纱布进行过滤，同时补充水分到1l，然后进行分装灭菌。

实施例中所涉及的核苷酸序列：

seqidno.1：

tgcaagtcgagcggatgacgggagcttgctccttgattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcgttaagttggatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcgagctagagtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttggaatccttgagattttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatgcagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgttatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggaggacggtaccac；

27f(seqidno.2)：agagtttgatcctggctcag；

1492r(seqidno.3)：ggttaccttgttacgactt；

p1(seqidno.4)：ggggtaccatggtgagcaagggcgaggaggata；

p2(seqidno.5)：cccaagcttctacttgtacagctcgtccatgccg。

实施例中涉及的质粒：

质粒pbbr1mcs5及含有红色荧光蛋白的质粒pmd19t-rfp均由南京农业大学资源与环境科学学院惠赠。

实施例1菌株选育

1.初筛：从双孢蘑菇栽培工厂采取蘑菇扭结期覆土层样品，称取10g土样到离心管中，稀释至100ml，振荡充分混匀，取稀释液继续稀释倍数至10^-3，取100ul菌液于选择性培养基上涂布。然后于30℃恒温培养箱中培养。待选择性培养基上生长合适数量菌落时，挑选单菌落在选择性培养基上划线于30℃恒温培养箱中纯化培养。

2.促生菌筛选：采取细菌与双孢蘑菇平板共培养的方式。用直径1cm打孔器将双孢蘑菇接种到pda培养基正中央，放至25℃培0养箱培养。约一周左右双孢菇直径长到2cm时，在其四周均匀滴加10μl菌液，并划线涂匀，放至25℃培养箱继续培养，定期观察，双孢蘑菇菌丝与细菌接触后如出现菌丝茂盛的情况，说明细菌能促进双孢蘑菇生长。结果从筛选到一株能明显促进双孢蘑菇菌丝生长的菌株，命名为tk3；

3.保存：将上述获得的细菌接到试管斜面中，划线30℃培养一天后，4℃保存；

4.鉴定：

(1)形态特征

将步骤1筛选到的菌株在lb培养基上划线，30℃培养24h，获得单菌落(如图3a所示)，菌落大小中等，表面湿润，边缘整齐；对该菌进行革兰氏染色，发现呈阳性(如图1所示)；液体培养后收集菌体，戊二醛法固定后，电镜观察菌体形态，并拍摄照片如图2所示，观测该菌体呈杆状，菌体长度为1-2μm，

(2)16srdna鉴定

利用细菌基因组dna试剂盒(omega公司)提取该菌株基因组dna作为模板，以27f(序列如seqidno.2所示)和1492r(序列如seqidno.3所示)分别作为上下游引物，进行16srdna基因扩增。

pcr反应体系：premixtaq(takara)25μl，模板0.1-2μg，上游引物10-100pmol，下游引物10-100pmol，双蒸水补足至50μl；

pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸5min。pcr扩增获得16srdna,序列长度1408bp，结果如seqidno.1所示；在ncbi数据库进行blast比对，并对该菌株进行分子进化系统发育树分析，鉴定其为恶臭假单胞菌(pseudomonasputida),申请人将该菌株自命名为tk3。

5.产吲哚乙酸(iaa)功能测定

采用salkowski法测定产吲哚乙酸的能力：将菌株tk3接种到液体lb培养基中，30中，哚乙酸的能pm/min培养12h。测定吸光度后将菌液在工作台操作下稀释到od600为0.8左右。取0.2ml接种到8ml含100mg/l色氨酸lb液体培养基中，培养48h后10000rpm/min离心5min，取上清液2ml加入4mlsalkowski显色液(10ml0.5mol/lfecl3和500ml35％高氯酸混合)，暗处放置0.5h后在540nm下测定吸光度，tk3产吲哚乙酸含量为41.2mg/l。

实施例2对pseudomonaspuditatk3进行红色荧光标记

1.红色荧光蛋白基因(rfp)扩增

根据红色荧光蛋白基因序列，采用bioedit软件设计目的片段引物p1(seqidno.2)和p2(seqidno.3)。

以含有红色荧光蛋白的质粒pmd19t-rfp为模板进行pcr扩增，反应体系如表1所示：

表150μlpcr体系

pcr反应条件：94℃预变性5min；94℃变性10s，55℃退火5s和72℃延伸1min，30个循环；最后72℃保持5min，获得rfp基因。

2.构建pbbr1mcs5-rfp表达载体

将质粒pbbr1mcs5和rfp分别用kpnⅰ和hindⅲ进行双酶切，酶切体系见表2和表3所示：

表2100μlpcr产物酶切体系

表3100μlpbbr1mcs5酶切体系

37℃水浴酶切>3h。0.75％琼脂糖凝胶鉴定酶切效果，采用axygen胶回收试剂盒回收目的基因片段。利用t4连接酶将回收的双酶切后的质粒pbbr1mcs5与rfp进行连接，酶切体系如表4所示，16℃酶连温度，酶连过夜(>8h)。获得表达质粒pbbr1mcs5-rfp，然后将质粒转化至大肠杆菌e.colidh5α。

表410μl酶连反应体系

3.恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)tk3电转化

取恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)tk3甘油冻存菌于lb培养基划线，放入30℃培养箱，24h培养至有单菌落。挑取单菌落于3mllb培养基中，放入摇床，温度设定为30℃，转速设定为200rpm，过夜培养。按照1:100比例接种0.5ml至50ml菌液于液体lb培养基中，lb培养基继续放入摇床培养，每隔1h取出lb培养基，在无菌操作台取样，测定其od600值，至od600值达0.6—0.75。将菌液5000rmp/min离心5-10min后收集菌体，弃上清。使用20ml预冷的1mmol/lhepes(ph7.0)对菌体进行3次洗涤。使用500μl，10％预冷甘油重悬，每1ml无菌的ep管中分装100μl，放置冰上备用。

将表达质粒pbbr1mcs5-rfp加入100μl恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)tk3电转感受态细胞中，电转化后，取0.9ml菌悬液，放入转速为200rpm的摇床，复苏1h30min。取50μl菌悬液涂布在gm100ppm的lb培养基，30℃培养箱培养至有转化子出现，使用菌落pcr进行验证，获得转入rfp基因阳性克隆，申请人将该菌株自命名为tk3rfp，并于2017年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101，保藏编号为：cgmccno.14367，分类命名为恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)。

实施例3pseudomonaspuditatkrfp荧光特性

将转入红色荧光蛋白的菌株tk3rfp和菌株tk3分别接种到lb培养基，30℃培养箱培养至对数期(培养8—14h)，取出平板，可以观察到菌株tk3rfp(图3b)呈红色，与白色的菌株tk3(图3a)形成鲜明对比。

将菌株tk3rfp和菌株tk3接种至lb培养液，30℃摇床过夜培养，取出试管放在260nm紫外灯下观察，菌株tk3rfp有明显的红色荧光出现(如图4中1、2所示)；图4中3、4为菌株tk3，紫外灯下观察无红色荧光出现。

为进一步验证红色荧光蛋白是否成功转入菌株tk3(rfp)，对菌株tk3rfp进行革兰染色，放至荧光显微镜下观察，经激发光激发呈现出红色菌落(如图5所示)，说明红色荧光蛋白(rfp)已成功导入菌株tk3(rfp)中。

实施例4pseudomonaspuditatkrfp对双孢蘑菇菌丝生长的促进作用

1.恶臭假单胞菌tk3rfp与双孢蘑菇平板共培养

用直径1cm打孔器将双孢蘑菇接种到pda培养基正中央，放至25℃培养箱培养。约一周左右双孢菇直径长到2cm时，在其四周均匀滴加10μllb培养基培养至tk3rfp菌含量为10⁸cfu/ml左右(即为tk3rfp菌液)，并划线涂匀，放至25℃培养箱继续培养，定期观察并记录菌丝生长量。结果如图6(培养7d后)所示，图6a为未接种tk3rfp菌液双孢蘑菇菌种生长情况；图6b为接种tk3rfp菌液后双孢蘑菇菌种生长情况图片，可见，恶臭假单胞菌(p.putida)与双孢蘑菇菌种在平板上共培养7d后，双孢蘑菇生长到与细菌接触的地方，菌丝生长更加浓密，双孢蘑菇菌丝能生长到覆盖细菌菌落。

2.恶臭假单胞菌tk3rfp与双孢蘑菇试管共培养

培养料：将麦粒浸泡24h后，煮6h之后晾干，每100g麦粒加入0.5g尿素和1g石膏，拌匀后装入；统一规格(30mm×200mm)大试管中，高度达到试管的2/3即可，121℃高压灭菌半小时，待冷却后备用；

用直径1cm打孔器从长满菌丝的双孢蘑菇平板上得到相同接种量的菌丝量，接种到培养料表面中心，塞上试管塞，将其放至25℃培养箱培养。培养2d后每个试管接入500μl步骤1获得的tk3rfp菌液(菌含量约10⁸cfu/ml)，放至25℃培养箱继续培养，定期观察并记录菌丝生长量，图7所示显示了共培养7d菌丝生长情况，图7中，1、2为接种恶臭假单胞菌tk3rfp菌液，ck为未接种恶臭假单胞菌tk3rfp菌液的对照组(加入等量无菌水代替菌液)，可见，添加tk3rfp菌液的双孢蘑菇菌丝生长速度加快。

3.恶臭假单胞菌tk3rfp提高双孢蘑菇产量

用塑料框装入双孢菇培养料(购自无锡市新锦源菌业科技有限公司)11kg，接种双孢蘑菇菌种，放至菇房25℃恒温生长。播种后20d左右待双孢蘑菇菌丝长满培养料表面时用消毒的草炭进行覆土，覆土厚度约3cm，覆土6d后，在覆土层喷施不同浓度的tk3rfp菌液，每1g覆土材料喷施的细菌数为10⁴、10⁵、10⁶(依次编号1-3)，每个处理6个重复(结果取平均值)，试验采收双孢蘑菇三潮产量，采收时间长达一个月，同时设立喷施相同量无菌水(ck)作为对照，经过数据统计结果如表5所示：

表5菌株tk3rfp对双孢蘑菇产量影响

由表5可见，实验组1-3喷施菌液tk3rfp后，双孢蘑菇产量高于对照处理(ck)。

在具体实施过程中，还可以通过本领域常规方法，将上述tk3rfp菌液制备成蘑菇菌剂(tk3rfp含菌量10⁸-10⁹cfu/ml)，作为蘑菇生物肥料，用以促进菌菇生长。

上述具体实施方式及试验，其目的为对本发明作详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的，因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>江苏丘陵地区南京农业科学研究所

<120>一株转入红色荧光蛋白的恶臭假单孢菌及其应用

<141>2017-08-22

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1408

<212>dna

<213>恶臭假单胞菌(pseudomonaspudita)

<400>1

tgcaagtcgagcggatgacgggagcttgctccttgattcagcggcggacgggtgagtaat60

gcctaggaatctgcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcata120

cgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcg180

gattagctagttggtggggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagag240

gatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggg300

gaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtctt360

cggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttg420

acgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagg480

gtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcgttaagttgg540

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tagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacacca660

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acaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttggaatcc780

ttgagattttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaa840

ggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaatt900

cgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatgcagagaactttccagagatggat960

tggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgag1020

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tgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtc1140

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aagccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaac1260

tcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgt1320

tcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagct1380

agtctaaccttcgggaggacggtaccac1408

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agagtttgatcctggctcag20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggttaccttgttacgactt19

<210>4

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggggtaccatggtgagcaagggcgaggaggata33

<210>5

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cccaagcttctacttgtacagctcgtccatgccg34