本发明涉及一种植物乳杆菌，尤其涉及一种食源性植物乳杆菌，还涉及其制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术：
烟叶陈化，又称烟叶发酵，是在一定温度和湿度条件下，烟叶理化特性发生深刻变化，烟叶香气、色泽和吸味品质明显改善的加工过程。烟叶陈化分为自然陈化和人工陈化。自然陈化指烟叶在自然条件下进行长时间发酵的一种方法；人工陈化是通过人为控制发酵的温度和湿度，在短时间内显著改善烟叶品质的一种方法。人工陈化可大大缩短发酵时间，但发酵后烟叶内各种成分比例不协调，发酵效果差；自然陈化对烟叶改善效果好，但耗时较长，易造成库存积压，影响经济效益。陈化烟叶表面存在大量微生物群落，包括占绝对优势细菌，少量放线菌和真菌。缩短发酵时间、增进烟叶香气、调控烟叶有害成分(如烟碱、亚硝胺等)是微生物在陈化烟叶过程中的3个主要功能。
将微生物资源应用于烟叶发酵是改善烟叶品质和增进烟叶香气的一种重要措施。早在1958年，izquierdo发现，接种微生物发酵的均得到改善，采用微球菌属(micrococcus)或芽孢杆菌属(bacillus)或两者的混合物接种烟叶时，效果更为显著。黄静文等(2010)将短小芽孢杆菌(b.pumilum)菌剂喷施于烟丝发酵21天后，烟叶化学成分比例更加协调，烟香和烟气增加，刺激性降低，卷烟吸味和品质显著改善。
乳酸菌是传统发酵食品中的主要菌群，且长期定居于人类肠道并有益于人体健康，是公认的食品级安全微生物，被广泛应用于酸奶、奶酪、馒头等食品的风味塑造。目前，应用在烟叶上的微生物大多为分离自烟叶表面或土壤中，鉴定发现有些是条件致病菌，所以存在一定的安全隐患。食品来源有益微生物应用在烟叶发酵上的报道较少，而单独利用乳酸菌改善烟叶香味和品质的报道未见。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种食源性植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)l8。
本发明的第二目的在于提供上述食源性植物乳杆菌的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述食源性植物乳杆菌的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
本发明从云南各州县采集豆豉样品若干份，利用改良mrs固体培养基和烟叶培养基，筛选分离到了一株能以烟叶为唯一营养源的植物乳杆菌l8。
上述食源性植物乳杆菌l8已于2017年8月28日保藏在中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；保藏号为cctccm2017457。
本发明的上述食源性植物乳杆菌的制备方法，按以下进行：
采集豆豉样品若干份，利用改良mrs固体培养基筛选乳酸菌，单菌落在mrs液体培养基中过夜培养后，保存于-80℃冰箱中，随机选取若干株乳酸菌，在烟叶培养基中划线分离，37℃培养48h，筛选分离得到一株能以烟叶为唯一营养源且长势最好的植物乳杆菌；
所述的改良mrs固体培养基：蛋白胨10g/l，牛肉粉8g/l，酵母粉4g/l，葡萄糖20g/l，吐温-801g/l，k2hpo42g/l，naac5g/l，mgso40.2g/l，mnso40.05g/l，柠檬酸三铵2g/l，caco310g/l，溴甲酚紫0.04g/l，琼脂15g/l，115℃灭菌20min；
所述的烟叶培养基：将品种为k326、具有1年陈化龄、由云南中烟有限责任公司原料部提供的烟叶磨成粉末，称取0.8-1.2g粉末和1.5-2g琼脂，用水调节至100ml，115℃灭菌20min。
本发明的上述植物乳杆菌在制备的烟丝发酵菌剂的应用，按以下进行：
植物乳杆菌l8在mrs液体培养基中活化14-18h，按4-6‰(v/v)接种于100mlmrs液体培养基中，30-37℃静置培养10-20h。8000-10000rpm，15-20min离心沉淀菌体，采用无菌去离子水洗涤2-3次菌体后，用无菌去离子水制成浓度为108-1010cfu/ml菌悬液。
本发明的上述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)l8在改善卷烟品质中的应用，包括如下步骤：
步骤(1)，发酵菌剂制备
按4-6‰接菌量，单位v/v，将在mrs液体培养基中活化14-18h的植物乳杆菌l8接种于100mlmrs液体培养基中，30-37℃静置培养10-20h，8000-10000rpm离心15-20min沉淀菌体，采用无菌去离子水洗涤2-3次菌体后，用无菌去离子水制成浓度为108-1010cfu/ml菌悬液，即得到植物乳杆菌l8发酵菌剂；
步骤(2)，卷烟品质改善
将4-6ml植物乳杆菌l8发酵菌剂，喷洒在含水率为11-12％的20-30g烟丝中，装入无菌食品袋中，于28-30℃，50-60％湿度，恒温恒湿培养箱中发酵7-14天，将发酵烟丝做成卷烟。感官评吸结果表明，发酵后卷烟烟气细腻醇和，杂气和刺激性明显减轻，酸香味突显，余味干净；化学成分和致香成分分析结果发现，发酵后烟丝中主要化学成分比例更加平衡，总酸含量(尤其是乙酸)和总醛含量(尤其是3-甲基丁醛)分别显著增加和减少。
进一步地，所述植物乳杆菌l8在改善卷烟品质中的应用，其最佳提升卷烟品质的条件为：步骤(1)中，接菌量为4‰，活化时间为16h，30℃静置培养10h，8000rpm离心20min沉淀菌体，无菌去离子水洗涤2次，发酵菌剂浓度为108cfu/ml；步骤(2)中，喷洒发酵菌剂的体积为6ml，烟丝重量为30g，烟丝含水量为12％，于30℃，60％湿度，恒温恒湿培养箱中发酵7天。
本发明所用到的发酵烟丝为从商品化云烟紫云中抽出的烟丝。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
(1)本发明提供了一种改善卷烟品质的食源性植物乳杆菌l8，来源于食品，不存在安全隐患；(2)本发明所述植物乳杆菌l8发酵烟丝后，烟气细腻醇和，杂气和刺激性明显减轻，酸香味突显，余味干净；烟叶的化学成分更加趋于平衡；致香成分发生了改变；(3)本发明提供了所述植物乳杆菌l8在改善卷烟品质中的最优发酵产香条件；(4)工艺简单，操作容易，成本低，适用于推广应用。
附图说明
图1为植物乳杆菌l8的生长和产酸曲线。cfu表示菌落形成单位(colonyformingunit)。
植物乳杆菌分类命名为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)l8，保藏日期：2017年8月28日于，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏编号为cctccm2017457。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品，实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所述实验结果，如无特殊说明，均为三次重复的平均值。本发明除非有特殊说明，否则百分数为质量百分数。
实施例1
一、植物乳杆菌l8的分离
1、培养基
(1)改良mrs固体培养基
本发明中所用到的改良mrs固体培养基：蛋白胨10g/l，牛肉粉8g/l，酵母粉4g/l，葡萄糖20g/l，吐温-801g/l，k2hpo42g/l，naac5g/l，mgso40.2g/l，mnso40.05g/l，柠檬酸三铵2g/l，caco310g/l，溴甲酚紫0.04g/l，琼脂15g/l，115℃灭菌20min。
(2)mrs液体培养基
蛋白胨10g/l，牛肉粉8g/l，酵母粉4g/l，葡萄糖20g/l，吐温-801g/l，k2hpo42g/l，naac5g/l，mgso40.2g/l，mnso40.05g/l，柠檬酸三铵2g/l，115℃灭菌20min；
(3)烟叶培养基
将品种为k326、具有1年陈化龄、由云南中烟有限责任公司原料部提供的烟叶磨成粉末，称取0.8g粉末和1.6g琼脂，用水调节至100ml，115℃灭菌20min。
(4)mrs固体培养基
本发明所用的mrs固体培养基：蛋白胨10g/l，牛肉粉8g/l，酵母粉4g/l，葡萄糖20g/l，吐温-801g/l，k2hpo42g/l，naac5g/l，mgso40.2g/l，mnso40.05g/l，柠檬酸三铵2g/l，琼脂15g/l，115℃灭菌20min。
2、菌株筛选
从云南各州县采集豆豉样品若干份，利用改良mrs固体培养基筛选乳酸菌，单菌落在mrs液体培养基中，37℃静置过夜培养后，保存于-80℃冰箱中。随机选取8株乳酸菌，在烟叶培养基中划线分离，37℃培养48h。选取1株长势最好菌株，命名为l8，接种于mrs固体培养基，37℃培养48h后，观察菌落形态，以备保藏和鉴定使用。
二、植物乳杆菌l8的鉴定
按照常规细菌鉴定方法进行生理生化特性分析。
利用细菌基因组提取试剂盒提取l8基因组dna，用16srdna通用引物27f(5’-agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5’-ggttaccttgttacgactt-3’)扩增l816srdna基因，并送往昆明硕擎生物技术有限公司进行测序。
其中，pcr扩增条件为：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，32个循环；72℃5min。序列信息提交至ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行在线比对分析。
在改良mrs固体平板上，菌落颜色为淡黄色或者乳白色，菌落周围紫色溴甲酚紫变为黄色，且有明显溶钙圈的单菌落，初步确定为乳酸菌。在8株乳酸菌中，l8在烟叶培养基中长势最好。其形态和生理生化特征为：革兰氏染色阳性，短杆状，无鞭毛，过氧化氢酶阴性，菌落形态规则、圆形、中间隆起、乳白色、表面光滑、边缘整齐。分子生物学鉴定分析显示，pcr产物长度为1440bp，与ncbi数据库中的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)具有很高的同源性(99～100％)。基于这些结果，将l8鉴定为植物乳杆菌。植物乳杆菌l816srdna的序列表为seqidno:1。
三、植物乳杆菌l8的生长和产酸曲线
从-80℃冰箱中取出植物乳杆菌l8菌株保藏液，按4‰(v/v)接种至5mlmrs液体培养基中，进行活化。活化好的菌液按4‰(v/v)接种于100mlmrs液体培养基中，30℃静置培养40h。每隔2h取样4ml，其中3ml用于od600和ph测定；1ml用mrs液体培养基进行10倍系列稀释，取10-8和10-9两个稀释度各100μl涂布于mrs固体平板，30℃静置培养40h后，记录菌落形成单位(cfu)数。
实验结果如图1所示，l8从第6h进入指数生长期，在第14h进入稳定生长期，22h后菌落数和od600值开始下降，推测其可能开始进入衰亡期。l8的产酸结果为：ph值从最初6.4开始缓慢下降到指数生长初期的6，然后急剧下降；在指数末期的ph值为4.1；最后ph值在稳定期和衰亡期稳定下来，如图1所示，维持在3.6左右，这些说明l8具有很强的产酸能力。
四、植物乳杆菌l8的应用
按4‰(v/v)接菌量，将在mrs液体培养基中活化14h的植物乳杆菌l8接种于100mlmrs液体培养基中，30℃静置培养20h。10000rpm离心15min沉淀菌体，采用无菌去离子水洗涤3次菌体后，用无菌去离子水制成浓度为109cfu/ml菌悬液，此即植物乳杆菌l8发酵菌剂。
从商品化云烟紫云中抽出烟丝，将4ml植物乳杆菌l8发酵菌剂，喷洒在含水率为12％的25g烟丝中，于恒温恒湿培养箱(30℃，50％湿度)中发酵7天，按常规方法制成卷烟，用于感官评吸。对照样品为用等量无菌水代替发酵菌剂，其他步骤同l8发酵。
感官评吸由云南中烟工业有限责任公司技术中心组织5名省级评吸专家，按照香气质、香气量、浓度、劲头、刺激性、余味、杂气量、燃烧性和灰色等9个指标进行评价，评吸得分越高，卷烟抽吸品质越好，反之亦然。结果发现，相比于对照，植物乳杆菌l8发酵处理后的卷烟，烟气细腻醇和，杂气和刺激性明显减轻，酸香味突显，余味干净。在总评分为50分情况下，发酵卷烟的分值为29.97，显著高于对照(29.56)。这些结果说明植物乳杆菌l8能显著改善烟叶吸食品质。
五、对植物乳杆菌l8产香条件进行优化。
选取发酵菌剂浓度、发酵温度和菌龄(即活化后的植物乳杆菌l8在mrs液体培养基中的培养时间)3个因素进行正交实验。其他条件为：在制备发酵菌剂时，接菌量为4‰，活化时间为16h，30℃静置培养15小时，8000rpm离心20min沉淀菌体，无菌去离子水洗涤2次；在制备卷烟时，喷洒发酵菌剂的体积为6ml，烟丝重量为30g，烟丝含水量为12％，发酵箱湿度为60％湿度，发酵时间为7天。
由表1可知，发酵菌剂浓度为108cfu/ml、发酵温度为37℃和菌龄为10h时，发酵卷烟的感官评吸值最高，分别比未优化和对照多4.13和4.54分，表明此为l8的最适产香发酵条件。
表1正交试验结果
六、烟丝经植物乳杆菌l8发酵后的化学成分变化
采用连续流动分析法，参考烟草行业标准yc/t159-2002，yc/t468-2013，yc/t468-2013，分别测定l8发酵处理前后的商品化云烟紫云的总糖和还原糖，总氮，总植物碱的含量。结果表明，经l8发酵处理后，烟丝中总氮和总植物碱含量没有变化，但总糖和总还原糖含量显著减少，造成糖氮比由10.11降低至9.41，糖碱比由9.16降低至8.49(表2)。这种下降使糖氮比和糖碱比均位于烤烟糖氮比和糖碱比最佳范围，使烟叶的糖、氮和碱等主要化合物及其比值更加趋于平衡，促进烟叶品质改善。
表2l8处理对烟丝主要化学成分的影响
注：*和**分别表示l8发酵烟丝与对照相比具有显著性差异(p<0.05和p<0.01)。
七、烟丝经植物乳杆菌l8发酵后的致香成分变化
利用顶空-固相微萃取技术分离挥发性化合物，每次萃取的烟样为0.5-0.6g，温度为60℃，时间为40min。气相色谱条件：色谱柱为db-waxetr型毛细管柱(60mm×0.25mm×0.25μm)；程序升温为初始温度60℃，保持5min，第一阶升温速率2℃/min，终温200℃，第二阶升温速率10℃/min，终温240℃，保持10min；进样口温度180℃；载气为高纯氦气；恒流模式，柱流量1.5ml/min，分流比10:1。质谱条件：电离方式为电子轰击源；电离能量70ev；传输线温度180℃；离子源温度200℃；溶剂延迟4min；质量范围33～400amu。对采集到的质谱图利用wiley和nist谱库进行串联检索，确定化合物身份，并利用峰面积归一化法计算各化学成分在样品中的相对含量。
由表3可知，经l8处理后，烟丝中致香成分的种类主要包括酸、醛、酮、醇等4大类，它们含量均超过了10％，其中醛的含量最多。具体来说，l8发酵烟丝较于对照增加(例如2-甲基丁酸)或减少(例如壬醛)了一些化合物种类，但这些化合物含量均很少。含量较多且变化很明显的化合物有乙酸和3-甲基丁醛，其中乙酸含量增加了9.17％，3-甲基丁醛含量减少了7.9％，使得总酸含量和总醛含量分别显著增加和减少。另外，一些含量较少但统计学分析显示发酵烟丝与对照间存在显著性差异的化合物有：丙酸、5-甲基呋喃醛、2-甲基呋喃、三氯甲烷和1,3-二甲基苯。这些化合物含量变化是l8改善烟叶吸食品质的主要原因。
表3l8发酵对烟丝致香成分的影响
注：相对含量指一种烟丝中单一化合物峰面积占总化合物峰面积的比例；—：未检测到；*和**：表示相比于对照，l8发酵烟丝分别在0.05和0.01水平具有显著性差异。m2b：2-甲基-2-丁烯醛；m1b：3-甲基-1-丁醇；m2fm：5-甲基-2-呋喃甲醇；m2h：6-甲基-2-庚醇；emmd2k：(e)-8-甲基-5-(1-甲基乙基)-6,8-壬二烯-2-酮；ma2k：6-甲基-5-庚烯-2-酮；emkb1k：(e)-1-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；mtf3k：2-甲基四氢呋喃-3-酮；ctk：2-环戊烯-1,4-二酮；mp4k：2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4h-吡喃-4-酮；a2a：乙酰氧基-2-丙酮；pgd：1,2-丙二醇二乙酸酯；tn：1,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基萘；hmi：2,3-二氢-1,1,5,6-四甲基-1h-茚。
实施例2
植物乳杆菌l8的应用
按6‰(v/v)接菌量，将在mrs液体培养基中活化18h的植物乳杆菌l8接种于100mlmrs液体培养基中，35℃静置培养16h。9000rpm离心18min沉淀菌体，采用无菌去离子水洗涤3次菌体后，用无菌去离子水制成浓度为109cfu/ml菌悬液，此即植物乳杆菌l8发酵菌剂。
从商品化云烟紫云中抽出烟丝，将6ml植物乳杆菌l8发酵菌剂，喷洒在含水率为12％的20g烟丝中，于恒温恒湿培养箱(30℃，60％湿度)中发酵12天，按常规方法制成卷烟，用于感官评吸。对照样品为用等量无菌水代替发酵菌剂，其他步骤同l8发酵。
实施例2感官评吸按照香气质、香气量、浓度、劲头、刺激性、余味、杂气量、燃烧性和灰色等9个指标进行评价，仍然能达到实施例1中植物乳杆菌l8应用的改善烟叶吸食品质的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>云南中烟工业有限责任公司
<120>一种食源性植物乳杆菌及其制备方法和应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1440
<212>dna
<213>植物乳杆菌l8(lactobacillusplantarum)
<400>1
tcatgcagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagt60
gagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctg120
gaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagcttgaaagatggc180
ttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctc240
accatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagaca300
cggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctga360
tggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaa420
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agtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagc660
ggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaa720
ctgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccata780
ccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgc840
attaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggg900
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tggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcg1080
caacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgaca1140
aaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacaca1200
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accatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttagaacagccgccaagt1440