本发明属于化学制药领域，具体涉及一类pi3k抑制剂和其药用组合物及其制备方法与应用。
背景技术：
磷脂酰肌醇3-激酶(pi3ks)是普遍存在的脂肪激酶，既作为细胞表面受体下游的信号转导器又作为在构成的细胞内膜和蛋白质交通通路中的信号转导器(vanhaesebroeck,b.etal.,naturerev.mol.cellbiol.,2010,11,329-341)。脂肪激酶的pi3k家族根据它们的生理学底物的特异性可以分成三组：类型i，类型ii和类型iii。在这三类型中，类型i得到了广泛地研究。类型ipi3k是由p110催化的亚单位和调节的亚单位构成的杂合二聚体。类型ipi3ks被进一步分为类型ia和类型ib酶。类型ia酶由三种不同的催化亚单位(p110，p1l0和p1l0)构成，这些亚单位与五种不同的调节亚单位(p85，p55，p50，p85和p55)二聚，其中所有催化亚单位能够与所有的调节亚单位相互作用以形成各种的杂二聚体，这些二聚体被称为pi3k,pi3k和pi3k。p110和p1l0基本上在所有的细胞类型中被表达，而p1l0主要表达于白细胞。单一类型的ib酶由与pl0l调节亚单位相互作用的p1l0催化亚单位构成，被称为pi3k。与p1l0一样，类型ib酶主要表达于白细胞。
pi3ks在很多类型的癌症中对于肿瘤的发生起了作用，这是由pi3k/akt通路的失调或过度活化而引起的(vivancoandsawyers,naturerev.cancer,2002,2,489-501)。在四个亚型中，pi3k在某些b-细胞癌症中对控制b-细胞的生存起了作用。例如，pi3k对非霍奇金淋巴瘤(nhl)和慢性淋巴细胞性白血病(cll)的生存很重要。pi3k抑制剂idelalisib在临床上已经被证明能治疗cll(furman,r.r.,etal.,thenewenglangjounalofmedicine,2014,370,997-1007；o’brien,s.,etal.,blood,2015,126,2686-2694),并被美国fda批准用于治疗这些疾病。这就充分表明，抑制pi3k的活性可以治疗b-细胞淋巴瘤和白血病，包括nhl和cll。
此外，pi3k的抑制可以破坏调节性t细胞介导的对肿瘤的免疫耐受，增加免疫反应，从而导致在动物模型里肿瘤的消退(ali,k.etal.,nature,2014,510,407-411)。这些发现表明，对pi3k和的抑制对于治疗肿瘤是有价值的，尤其是那些对于免疫反应不充足的肿瘤，例如乳癌，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，支气管肺泡癌)，前列腺癌，胆小管癌，骨癌，膀胱癌，头颈癌，肾癌，肝癌，胃肠组织癌，食道癌，卵巢癌，胰腺癌，皮肤癌，睾丸癌，甲状腺癌，子宫癌，宫颈癌和阴道癌，白血病，多发性骨髓瘤和淋巴瘤等。
除了肿瘤之外，还有证据表明pi3k在炎症和自身免疫性疾病中也扮演重要的角色(puri,k.d.etal.,j.immunol.,2009,182(suppl.50),14；maxwell,m.j.etal.,j.autoimmunity,2012,38,381-391；suarez-fueyo,a.etal.,j.immunol.,2011,187,2376-2385)。于是，对pi3k的抑制可以用于治疗炎症和自身免疫性疾病，包括但不限于皮肤炎症，类风湿性关节炎，过敏性鼻炎，哮喘，克氏病，慢性阻塞性肺疾病(copd)，系统性红斑狼疮，牛皮癣，多发性硬化症，活化的pi3k综合症，和sjogren综合症等。
本发明涉及新一代的pi3k抑制剂，可用于治疗癌症，炎性和自身免疫性疾病。
技术实现要素：
本发明的一个方面，提供了式(i)的化合物：
或其药用盐，其中：
r1选自h，卤素，氰基，烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，环烷基，或杂环烷基，其中所述的烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，环烷基，或杂环烷基可选地被1至5个r1a取代；
r1a选自h，氘，卤素，氰基，烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，环烷基，和杂环烷基，其中所述的烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，环烷基，或杂环烷基可选地被卤素，氰基，ora，sra，nrbrc，烷基，烯基，炔基，环烷基，或杂环烷基取代；
r2选自芳基，杂芳基，环烷基，或杂环烷基，其中r2可选地被1至5个r2a取代；
r2a选自h，卤素，氰基，ora，sra，nrbrc，nrbc(o)rd，nrbc(o)ord，nrbc(o)nrbrc，nrbs(o)2rd，nrbs(o)2nrbrc，c(o)nrbrc，c(o)ord，s(o)2nrbrc，c(o)rd，s(o)2rd，p(o)rbrc，烷基，烯基，或炔基；
r3选自h，氘，烷基，烯基，炔基，氘代烷基，卤代烷基，羟烷基，烷氧基烷基，氰基烷基，环烷基，或环烷基烷基；
r4选自h，烷基，羟烷基，烷氧基烷基，卤代烷基，氰基烷基，环烷基，或环烷基烷基；
r5选自h，卤素，氰基，烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，环烷基，或杂环烷基，其中所说的烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，环烷基，或杂环烷基可以被1-3个r5a取代；
r5a选自h，氘，卤素，氰基，ora，sra，nrbrc，nrbc(o)rd，nrbc(o)ord，nrbc(o)nrbrc，nrbs(o)2rd，nrbs(o)2nrbrc，c(o)nrbrc，c(o)ord，s(o)2nrbrc，c(o)rd，s(o)2rd，p(o)rbrc，烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，环烷基，或杂环烷基；
r6和r7各选自h，氨基，或烷基；
ra，rb，rc，和rd独立选自h，烷基，卤代烷基，羟烷基，烷氧基烷基，氰基烷基，烯基，炔基，环烷基，杂环烷基，芳基，或杂芳基；
或者rb和rc与和它们连接的氮原子一起形成4至7元杂环烷基，可选地被1至3个re取代；
re选自h，卤素，氰基，ora，sra，nrbrc，nrbc(o)rd，nrbc(o)ord，nrbc(o)nrbrc，nrbs(o)2rd，nrbs(o)2nrbrc，c(o)nrbrc，c(o)ord，s(o)2nrbrc，c(o)rd，s(o)2rd，p(o)rbrc，烷基，烯基，炔基，环烷基，杂环烷基，芳基，或杂芳基。
优选地，本发明提供了式(ii)化合物:
或其药用盐，其中：
r1选自h，卤素，氰基，烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，环烷基，或杂环烷基，其中所述的烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，环烷基，或杂环烷基可选地被1至5个r1a取代；
r1a选自h，氘，卤素，氰基，烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，环烷基，和杂环烷基，其中所述的烷基，烯基，炔基，芳基，杂芳基，环烷基，或杂环烷基可选地被卤素，氰基，ora，sra，nrbrc，烷基，烯基，炔基，环烷基，或杂环烷基取代；
r2a选自h，卤素，氰基，ora，sra，nrbrc，nrbc(o)rd，nrbc(o)ord，nrbc(o)nrbrc，nrbs(o)2rd，nrbs(o)2nrbrc，c(o)nrbrc，c(o)ord，s(o)2nrbrc，c(o)rd，s(o)2rd，p(o)rbrc，烷基，烯基，或炔基；
r3选自h，氘，烷基，烯基，炔基，氘代烷基，卤代烷基，羟烷基，烷氧基烷基，氰基烷基，环烷基，或环烷基烷基；
r6和r7各选自h，氨基，或烷基；
ra，rb，rc，和rd独立选自h，烷基，卤代烷基，羟烷基，烷氧基烷基，氰基烷基，烯基，炔基，环烷基，杂环烷基，芳基，或杂芳基；
或者rb和rc与和它们连接的氮原子一起形成4至7元杂环烷基，可选地被1至3个re取代；
re选自h，卤素，氰基，ora，sra，nrbrc，nrbc(o)rd，nrbc(o)ord，nrbc(o)nrbrc，nrbs(o)2rd，nrbs(o)2nrbrc，c(o)nrbrc，c(o)ord，s(o)2nrbrc，c(o)rd，s(o)2rd，p(o)rbrc，烷基，烯基，炔基，环烷基，杂环烷基，芳基，或杂芳基；
n为1，2，或3。
在一个优选实施方案中，r1选自卤素，氰基，烷基，卤代烷基，环烷基，杂环烷基，芳基，和杂芳基。
在一个更优选实施方案中，r1选自卤素。
在一个优选实施方案中，r2a选自h和卤素。
在一个更优选实施方案中，r2a选自h和氟。
在一个优选实施方案中，r3选自烷基，卤代烷基，和环烷基。
在一个更优选实施方案中，r3选自烷基。
在一个优选实施方案中，r4选自h和烷基。
在一个更优选实施方案中，r4选自h。
在一个优选实施方案中，r5选自卤素，氰基，炔基，环烷基炔基，芳基炔基，杂芳基炔基，芳基，和杂芳基。
在一个更优选实施方案中，r5选自氰基。
在一个优选实施方案中，r6选自h，氨基，和烷基。
在一个优选实施方案中，r7选自h和氨基。
术语“卤基”或“卤素”包括氟，氯，溴，和碘。
术语“烷基”是指直链或支链的饱和烃基团。烷基的实例包括甲基(me)，乙基(et)，丙基(例如正丙基和异丙基)，丁基(例如正丁基，异丁基，特丁基)，戊基(例如正戊基，异戊基，新戊基)，己基(例如正己基，2-己基，3-己基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，2,2-二甲基丁基，3-乙基戊基-1等)，庚基(例如正庚基，2-庚基，3-庚基，4-庚基，2-甲基己基，3-甲基己基，2,2-二甲基戊基，3,3-二甲基戊基，3-乙基戊基-1等)，辛基(例如1-辛基，2-辛基，2-乙基己基等)，壬基(如1-壬基)，癸基(如正癸基等)，以及类似基团。尤其是指碳原子数为1至20的直链或支链的烷基，更具体是指原子数为1至10的直链或支链烷基，进一步优选的是指原子数为1至6的直链或支链的烷基。除非有相反定义，本发明中的所有基团定义如在本文中所定义。
术语“羟烷基”是指用羟基取代的烷基基团，其中烷基基团的定义如上。
术语“卤代烷基”是指具有一个或多个卤素取代基的烷基基团。其中烷基基团和卤基或卤素的定义如上。卤代烷基基团的实例包括ch2f，chf2，cf3，c2f5，ccl3，以及类似基团。
术语“氰基烷基”是指用氰基基团(-cn)取代的烷基基团。
术语“烯基”是指具有一个或多个c＝c双键的烃基基团。烯基基团的实例包括乙烯基，丙烯基，烯丙基，1-丁烯基，2-丁烯基，1,3-丁二烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，1,3-戊二烯基，1-己烯基，2-己烯基等，以及类似基团。
术语“炔基”是指具有一个或多个c≡c三键的烃基基团。炔基基团的实例包括乙炔基，丙炔基，炔丙基，1-丁炔基，2-丁炔基，1-戊炔基，2-戊炔基，1-己炔基，2-己炔基等，以及类似基团。
术语“环烷基”是指非芳香碳环，包括环化的烷基，环化的烯基，和环化的炔基基团。环烷基基团可以是单环或多环(例如具有2，3或4个稠合环)的环系统，包括螺环。在某些实施方式中，环烷基基团可以具有3至20个碳原子。环烷基基团可以进一步具有0，1，2或3个c＝c双键和/或0，1或2个c≡c三键。同时被包括在环烷基的定义中的还有那些具有一个或多个稠合于环烷基环的芳香环(例如具有共用的键)的部分，例如戊烷，戊烯，己烷，己烯的苯并衍生物等，以及类似化合物。具有一个或多个稠合芳环的环烷基可以通过芳香部分或非芳香部分连接。环烷基基团的实例包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，环戊烯基，环己烯基，环己二烯基，环庚烯基，环庚二烯基，金刚烷基，以及类似基团。
术语“杂环烷基”是指其中一个或多个形成环的原子是o，n，s或磷这样的杂原子的非芳香杂环。杂环基基团可以包括单环或多环(如具有2，3或4个稠合环)的环系统以及螺环。优选的“杂环烷基”基团的实例包括但不限于：吖丙啶基(氮杂环丙烷基)，吖丁啶基(氮杂环丁烷基)，四氢呋喃基，四氢噻吩基，吡咯烷基，噁唑烷基，噻唑烷基，咪唑烷基，异噁唑烷基，异噻唑烷基，吡唑烷基，吗啉基，硫代吗啉基，哌嗪基，哌啶基，以及类似基团。同时被包括在杂环烷基的定义中还有那些具有一个或多个稠合于非芳香杂环烷基环的芳香环(例如具有共用的键)的部分，例如2,3-二氢苯并呋喃基，1,3-苯并二氧杂环戊烯基，苯并-1,4-二氧杂环己基，邻苯二甲酰亚胺基，萘二甲酰亚胺基，以及类似基团。具有一个或多个稠合芳环的杂环烷基基团可以通过芳香部分或非芳香部分连接。杂环烷基中的氮和硫原子可以以氧化的形式存在。
术语“芳基”是指单环或多环(例如具有2，3或4个稠合环)的芳烃，例如苯基，萘基，蒽基，菲基，茚基，以及类似基团。
术语“杂芳基”是指具有至少一个如o，n或s这样的杂原子环成员的芳香杂环。杂芳基基团包括单环或多环(如具有2，3或4个稠合环)的环系统。任何在杂环基团中成环的n原子也可以被氧化以形成n-氧化物。优选的“杂芳基”基团的是实例包括但不限于：吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，哒嗪基，三嗪基，呋喃基，噻吩基，咪唑基，三唑基，四唑基，噻唑基，异噻唑基，1,2,4-噻二唑基，吡咯基，吡唑基，噁唑基，异噁唑基，噁二唑基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，苯并噻唑基，吲哚基，吲唑基，喹啉基，异喹啉基，嘌呤基，咔唑基，苯并咪唑基，吡咯并吡啶基，吡咯并嘧啶基，吡唑并吡啶基，吡唑并嘧啶基，以及类似基团。
术语“化合物”，如在本文中所使用，是指包括所有的立体异构体，几何异构体，互变异构体，同位素。
本发明的化合物可以是非对称的，例如具有一个或多个立体中心。除非有另外的限定，所有的立体异构体，例如是对映异构体和非对映异构体。含有非对称取代的碳原子的本发明的化合物可以被分离成光学纯或外消旋形式。光学纯形式可以通过外消旋体的拆分来制备，或者通过使用手性合成子(synthon)或手性试剂来制备。
本发明的化合物也可以包括互变异构体形式。互变异构体新形式由单键和相邻的双键一起伴随质子的迁移而互换所产生的。
本发明的化合物也可以包括存在于中间体或最终化合物中的原子的所有同位素形式。同位素包括具有相同的原子序数但不同的质量数的那些原子。例如，氢的同位素包括氘和氚。
本发明还包括式(i)化合物的药用盐。药用盐是指其中母体化合物通过所存在的碱部分转化成它的盐形式而进行改性的化合物的衍生物，或者其中母体化合物通过所存在的酸部分转化成它的盐形式而进行改性的化合物的衍生物。药用盐的实例包括但不限于：碱性基团(如胺)的无机或有机酸的盐，或者酸性基团(如羧酸)的无机或有机碱的盐。本发明的药用盐可以由式i的母体化合物通过在溶剂体系中使这些化合物的游离碱形式与1-4当量适当的酸反应而合成。合适的盐被在remington’spharmaceuticalsciences,17thed.,mackpublishingcompany,easton,pa.,1985,p.1418和journalofpharmaceuticalscience,66,2(1977)中列出。
本发明的化合物，以及其药用盐还包括溶剂化物形式或水合物形式。一般而言，溶剂化物形式或水合物形式与非溶剂化物形式或非水合物形式是等同的，均包括在本发明的范围内。本发明的一些化合物可以以多种晶型形式或非晶形式存在。总体而言，化合物的所有的物理形式都包括在本发明的范围内。
本发明还包括式(i)化合物的前药。前药是一种由母体药物衍生的药理学物质(即药物)一旦给药之后，前药在体内被代谢成为母体药物。前药可以通过取代在化合物中存在的一个或多个官能团来制备，其中前药中的取代基在体内以这样一种方式被去除而转化成母体化合物。关于前药的制备和使用可以在t.higuchiandv.stella,“pro-drugsasnoveldeliverysystems,”vol.14ofthea.c.s.symposiumseries和bioreversiblecarriersindrugdesign,ed.edwardb.roche,americanpharmaceuticalassociationandpergamonpress,1987中找到。.
本发明还提供了一种组合物，包括式(i)化合物以及药用载体或赋形剂。本发明的组合物可以通过口服给药，胃肠外给药(注射给药)，喷雾吸入，局部给药，经直肠给药，经鼻腔给药，阴道给药，腹膜内给药或经由植入的储库给药。
在本发明的另一方面，本发明提供一种利用式(i)化合物调节激酶活性的方法。术语“调节激酶活性”如在本文中所使用，是指与本发明的式(i)化合物接触激酶时所降低的激酶活性相对于不存在式(i)化合物时的激酶活性。因此，本申请提供了通过将激酶与本发明的式(i)化合物接触来调节激酶活性的方法。
在一些实施方案中，激酶是脂肪激酶，如pi3k，pi3k，pi3k，或pi3k。
在一些实施方案中，激酶是pi3k。
本发明的另一方面，本发明提供了本发明化合物用于治疗由pi3k介导的疾病的方法。与pi3k相关的疾病包括癌症，炎症和自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，本发明所述的癌症是实体瘤，白血病，淋巴瘤，和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，本发明所述的白血病选自急性淋巴细胞白血病(all)，急性髓性白血病(aml)，慢性淋巴细胞白血病(cll)，和慢性髓性白血病(cml)；所述的淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(nhl)，套细胞淋巴瘤(mcl)，滤泡淋巴瘤，b-细胞淋巴瘤，t-细胞淋巴瘤，和弥漫性大b-细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，本发明所述的自身免疫性疾病和炎性疾病选自皮肤炎症，类风湿性关节炎、过敏性鼻炎，哮喘，克氏病，慢性阻塞性肺疾病(copd)，系统性红斑狼疮，牛皮癣，多发性硬化症，活化的pi3k综合症，和sjogren综合症。
本发明的另一方面，本发明提供了本发明的化合物或其药用盐或药物组合物与一种或多种药物的联合使用，用于治疗癌症，炎症和自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，本发明所指的联合用药药物包括小分子化合物和大分子抗体药物。小分子化合物选自但不限于各种激酶抑制剂例如btk抑制剂，以及其它小分子非激酶抑制剂等；大分子药物包括抗-cd20，抗-ctla4，抗-pd-1，抗-pd-l1抗体等。
在本发明的另一方面，本发明提供了用于制备式(i)化合物的方法。本发明的化合物可以通过以下描述的反应过程和方法来制备。
反应流程1
式(i)的化合物可以用反应流程1中列出的合成路线来制备。起始原料i-1与n,n-二甲基甲酰胺二甲基缩醛在甲苯中回流得到i-2。化合物i-2与3-氨基吡唑在醋酸中反应得到关环产物吡唑并嘧啶i-3。用ncs对i-3进行氯化反应得到氯化产物i-4。i-4中的酯基水解后，形成的羧酸i-5与n,o-二甲基羟氨缩合得到酰胺化合物i-6。格式试剂r3mgcl与i-6中的酰胺键加成后，形成的酮i-7与(r)-亚磺酰胺缩合得到i-8。i-8中的亚氨基用三仲基硼氢化锂还原得到s构型的亚磺酰胺化合物i-9。亚磺酰基用盐酸脱去后，其游离氨基i-10与y-l(y为r5，r6，和r7取代的嘧啶，l为离去基团)反应得到最终产物(i)。
以下实施例是用来说明本发明的优选实施方式的。本领域技术人员应当明了，在以下实施例中披露的技术表示由本发明人发现的并在本发明的实施中很好地起作用的技术，因此可以被认为构成了其实施的优选方式。然而，根据本发明披露的内容，本领域技术人员应当明了，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，对所披露的特定的实施方式可以作出多种变化并仍然获得相同或类似的结果。
实施例1.
(s)-4-氨基-6-(1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺)嘧啶-5-甲腈
步骤1.5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-羧酸乙酯
于250ml圆底烧瓶中，加入苯甲酰甲酸乙酯(10g，56.2mmol)，n,n-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(6.7g，56.2mmol)，甲苯120ml，回流反应2小时。反应完成后，减压蒸馏除去甲苯。所得余物溶于200ml乙醇，搅拌下加入3-氨基吡唑(4.7g，56.6mmol)，冰乙酸40ml，室温反应8小时。反应完成后，减压蒸馏除去乙醇，余物加h2o稀释，以ch2cl2萃取。所得有机相依次以饱和na2co3溶液，饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩得黄色固体14.2g，直接用于下步反应，产率94％。lcms(esi):m/z＝268(m+h)+。
步骤2.3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-羧酸乙酯
将5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-羧酸乙酯(14.2g，53.1mmol)溶于150mlchcl3，加入ncs(7.1g，53.2mmol)，升温到60℃反应6小时。反应完成后，以ch2cl2稀释，依次以0.1nhcl水溶液，饱和nacl溶液洗涤。有机相以无水na2so4干燥，过滤后浓缩得黄色固体15.5g，直接用于下步反应，产率97％。lcms(esi):m/z＝302(m+h)+。
步骤3.3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-羧酸
于250ml圆底烧瓶中，加入3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-羧酸乙酯(15.5g，51.5mmol)，甲醇50ml，2nnaoh水溶液100ml，室温反应5小时。反应完成后，减压蒸馏除去甲醇，过滤，滤渣以h2o洗涤。所得滤液以4nhcl水溶液调ph＝3，析出固体，过滤，得到固体8.2g，产率58％。lcms(esi):m/z＝274(m+h)+。
步骤4.3-氯-n-甲氧基-n-甲基-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-酰胺
将3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-羧酸(8.2g，30mmol)，diea(11.6g，90mmol)溶于100mlch2cl2中，搅拌下加入n,o-二甲基羟胺盐酸盐(3.2g，33mmol)，hatu(12.5g，33mmol)，室温反应2小时。反应完成后，以ch2cl2稀释，有机相以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩，所得余物柱层析纯化(pe∶etoac(v/v)＝2∶1)得固体8.5g，产率90％。lcms(esi):m/z＝317(m+h)+。
步骤5.1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙酮
氮气保护下，将3-氯-n-甲氧基-n-甲基-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-酰胺(8.5g，26.9mmol)溶于80mlthf，置于冰浴中冷却。往上溶液缓慢滴入甲基氯化镁的thf溶液(3m，14ml)，20min滴完。滴完后维持温度反应1小时。反应完成后，小心加入饱和nh4cl溶液淬灭反应，减压蒸馏除去thf。水相以etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩得固体6.5g，产率89％。lcms(esi):m/z＝272(m+h)+。
步骤6.(r,e)-n-(1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)亚乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺
将(r)-叔丁基亚磺酰胺(3g，24.8mmol)溶于30mlthf中，滴入1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙酮(6.5g，24mmol)和钛酸四乙酯(11g，48.2mmol)的thf溶液(50ml)。然后升温回流反应4小时。反应完成后，冷至室温，加入饱和nh4cl溶液，减压蒸馏除去thf。水相以etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩，所得余物柱层析纯化(pe∶etoac(v/v)＝1∶1)得固体4.2g，产率45％。lcms(esi):m/z＝375(m+h)+。
步骤7.(r)-n-((s)-1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺
氮气保护下，将(r,e)-n-(1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)亚乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(4.2g，11.2mmol)溶于40mlthf中，冷却至-40℃。维持温度，缓慢滴入三仲丁基硼氢化锂的thf溶液(1m，22ml)。滴完后维持温度反应1小时。反应完成后，加入饱和nh4cl溶液，搅拌5min，升至室温，减压蒸馏除去thf，水相以etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩，所得余物柱层析纯化(pe∶etoac(v/v)＝1∶1)得固体2g，产率47％。lcms(esi):m/z＝377(m+h)+。
步骤8.(s)-1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺
将(r)-n-((s)-1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(2g，5.3mmol)溶于10mlmeoh中，加入浓盐酸(4ml)，室温搅拌反应1小时。反应完成后，置于冰浴冷却，以饱和na2co3溶液调ph＝9。减压蒸馏除去甲醇，水相以etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩得固体1.2g，产率83％。lcms(esi):m/z＝273(m+h)+。
步骤9.(s)-4-氨基-6-(1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺)嘧啶-5-甲腈
于25ml圆底烧瓶中，加入(s)-1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺(150mg，0.55mmol)，4-氨基-5-腈基-6-氯嘧啶(85mg，0.55mmol)，kf(64mg，1.1mmol)，diea(355mg，2.75mmol)，dmso(5ml)，升温到90℃反应2小时。反应完成后，加h2o稀释，etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩。所得余物柱层析纯化(pe∶etoac(v/v)＝1∶1)得固体178mg，产率83％。lcms(esi):m/z＝391(m+h)+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.69(s,1h),8.03(s,1h),8.01(s,1h),7.84–7.69(m,1h),7.66–7.55(m,3h),7.52-7.32(m,1h),5.59(d,j＝6.2hz,1h),5.51(s,2h),5.26-5.14(m,1h),1.57(d,j＝7.1hz,3h).
实施例2.
(s)-2,4-二氨基-6-(1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺)嘧啶-5-甲腈
步骤1.2,4,6-三氯嘧啶-5-甲醛
于150ml圆底烧瓶中，加入pocl3(76.5g，0.5mmol)，置于冰浴冷却，缓慢加入dmf(5.7g，78mmol)，维持温度反应20min。往上溶液加入巴比妥酸(10g，78mmol)，撤去冰浴，加热回流反应12小时。反应完成后，减压蒸馏除去剩余的pocl3，余物倒入碎冰中，以etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩得10g油状物，直接用于下步反应。产率61％。
步骤2.2,4,6-三氯嘧啶-5-甲腈
于150ml圆底烧瓶中，加入2,4,6-三氯嘧啶-5-甲醛(10g，47.4mmol)，盐酸羟胺(3.3g，47.5mmol)，冰乙酸(100ml)和h2o(5ml)，加热到60℃反应1小时。反应完成后，将反应液倒到碎冰中，以ch2cl2萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩，所得物溶于socl2(60ml)，室温反应10min，然后加热回流反应2小时。反应完成后，减压蒸馏除去socl2，余物溶于etoac，以h2o洗涤，有机相以无水na2so4干燥，过滤后浓缩得油状物9g。产率92％。
步骤3.2,4-二氨基-6-氯嘧啶-5-甲腈
于150ml圆底烧瓶中，加入2,4,6-三氯嘧啶-5-甲腈(9g，43.5mmol)，二氧六环(40ml)和氨水(36％，40ml)，加热到50℃反应1小时。反应完成后，冷至室温，加入50ml冰水并置于冰水浴中冷却，搅拌1.5小时。然后将所得混合物过滤，滤渣以h2o洗，得淡黄色固体3.8g，产率51％。lcms(esi):m/z＝170(m+h)+。
步骤4.(s)-2,4-二氨基-6-(1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺)嘧啶-5-甲腈
于25ml圆底烧瓶中，加入(s)-1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺(150mg，0.55mmol)，2,4-二氨基-6-氯嘧啶-5-甲腈(93mg，0.55mmol)，kf(64mg，1.1mmol)，diea(355mg，2.75mmol)，dmso(5ml)，升温到90℃反应2小时。反应完成后，加h2o稀释，etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩。所得余物柱层析纯化(pe∶etoac(v/v)＝1∶1)得固体156mg，产率70％。lcms(esi):m/z＝406(m+h)+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.71(s,1h),8.02(s,1h),7.79-7.69(m,1h),7.69-7.56(m,3h),7.50-7.38(m,1h),5.47(d,j＝6.7hz,1h),5.31–5.08(m,3h),4.80(s,2h),1.57(d,j＝7.1hz,3h).
实施例3.
(s)-2,4-二氨基-6-(1-(3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺)嘧啶-5-甲腈
步骤1.3-(3-氟苯基)-3-羰基丙酸乙酯
将叔丁醇钾(20g，178.6mmol)溶于200mlthf中，冷却至-20℃，滴入3-氟苯甲酸乙酯(10g，59.5mmol)，维持温度反应30min。然后缓慢滴入乙酸乙酯(15.7g，178.4mmol)，滴完后维持温度反应1小时。反应完成后，加入3nhcl水溶液(75ml)，减压蒸馏除去thf，水相以etoac萃取，合并有机相，依次以饱和na2co3和饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩得5g油状物，直接用于下步反应，产率40％。lcms(esi):m/z＝211(m+h)+。
步骤2.5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-羧酸乙酯
于250ml圆底烧瓶中，加入3-(3-氟苯基)-3-羰基丙酸乙酯(5g，23.8mmol)，n,n-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(2.9g，24.4mmol)，甲苯50ml，回流反应2小时。反应完成后，减压蒸馏除去甲苯。所得余物溶于100ml乙醇，搅拌下加入3-氨基吡唑(2g，24mmol)，冰乙酸20ml，室温反应8小时。反应完成后，减压蒸馏除去乙醇，余物加h2o稀释，以ch2cl2萃取。所得有机相依次以饱和na2co3溶液，饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩得黄色固体4.3g，直接用于下步反应，产率63％。lcms(esi):m/z＝286(m+h)+。
步骤3.3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-羧酸乙酯
将5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-羧酸乙酯(4.3g，15.1mmol)溶于50mlchcl3，加入ncs(2.1g，15.7mmol)，升温到60℃反应6小时。反应完成后，以ch2cl2稀释，依次以0.1nhcl水溶液，饱和nacl溶液洗涤。有机相以无水na2so4干燥，过滤后浓缩得黄色固体4.6g，直接用于下步反应，产率95％。lcms(esi):m/z＝320(m+h)+。
步骤4.3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-羧酸
于100ml圆底烧瓶中，加入3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-羧酸乙酯(4.6g，14.4mmol)，甲醇20ml，2nnaoh水溶液60ml，室温反应5小时。反应完成后，减压蒸馏除去甲醇，过滤，滤渣以h2o洗涤。所得滤液以4nhcl溶液调ph＝3，析出固体，过滤，得到固体2.3g，产率55％。lcms(esi):m/z＝292(m+h)+。
步骤5.3-氯-5-(3-氟苯基)-n-甲氧基-n-甲基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-酰胺
将3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-羧酸(2.3g，7.9mmol)，diea(3g，23.3mmol)溶于20mlch2cl2中，搅拌下加入n,o-二甲基羟胺盐酸盐(850mg，8.7mmol)，hatu(3.3g，8.7mmol)，室温反应2小时。反应完成后，以ch2cl2稀释，有机相以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩，所得余物柱层析纯化(pe∶etoac(v/v)＝2∶1)得固体2g，产率76％。lcms(esi):m/z＝335(m+h)+。
步骤6.1-(3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙酮
氮气保护下，将3-氯-5-(3-氟苯基)-n-甲氧基-n-甲基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-酰胺(2g，6mmol)溶于20mlthf，置于冰浴中冷却。往上溶液缓慢滴入甲基氯化镁的thf溶液(3m，3ml)，20min滴完。滴完后维持温度反应1小时。反应完成后，小心加入饱和nh4cl溶液淬灭反应，减压蒸馏除去thf。水相以etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩得固体1.5g，产率87％。lcms(esi):m/z＝290(m+h)+。
步骤7.(r,e)-n-(1-(3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)亚乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺
将(r)-叔丁基亚磺酰胺(692mg，5.7mmol)溶于10mlthf中，滴入1-(3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙酮(1.5g，5.2mmol)和钛酸四乙酯(2.4g，10.5mmol)的thf溶液(20ml)。然后升温回流反应4小时。反应完成后，冷至室温，加入饱和nh4cl溶液，减压蒸馏除去thf。水相以etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩，所得余物柱层析纯化(pe∶etoac(v/v)＝1∶1)得固体840mg，产率41％。lcms(esi):m/z＝393(m+h)+。
步骤8.(r)-n-((s)-1-(3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺
氮气保护下，将(r,e)-n-(1-(3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)亚乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(840mg，2.14mmol)溶于10mlthf中，冷却至-40℃。维持温度，缓慢滴入三仲丁基硼氢化锂的thf溶液(1m，4.3ml)。滴完后维持温度反应1小时。反应完成后，加入饱和nh4cl溶液，搅拌5min，升至室温，减压蒸馏除去thf，水相以etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩，所得余物柱层析纯化(pe∶etoac(v/v)＝1∶1)得固体600mg，产率71％。lcms(esi):m/z＝395(m+h)+。
步骤9.(s)-1-(3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺
将(r)-n-((s)-1-(3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(600mg，1.52mmol)溶于5mlmeoh中，加入浓盐酸(2ml)，室温搅拌反应1小时。反应完成后，置于冰浴冷却，以饱和na2co3溶液调ph＝9。减压蒸馏除去甲醇，水相以etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩得固体400mg，产率91％。lcms(esi):m/z＝291(m+h)+。
步骤10.(s)-2,4-二氨基-6-(1-(3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺)嘧啶-5-甲腈
于25ml圆底烧瓶中，加入(s)-1-(3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺(100mg，0.34mmol)，2,4-二氨基-5-腈基-6-氯嘧啶(58mg，0.34mmol)，kf(40mg，0.69mmol)，diea(219mg，1.7mmol)，dmso(5ml)，升温到90℃反应2小时。反应完成后，加h2o稀释，etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩。所得余物柱层析纯化(pe∶etoac(v/v)＝1∶1)得固体70mg，产率51％。lcms(esi):m/z＝406(m+h)+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.70(s,1h),8.03(s,1h),7.72-7.52(m,2h),7.45-7.28(m,2h),5.44-5.29(m,1h),5.26-5.13(m,1h),5.09(s,2h),4.78(s,2h),1.55(d,j＝7.0hz,3h).
实施例4.
(s)-4-氨基-6-(1-(3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺)嘧啶-5-甲腈
于25ml圆底烧瓶中，加入(s)-1-(3-氯-5-(3-氟苯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺(100mg，0.34mmol)，4-氨基-5-腈基-6-氯嘧啶(53mg，0.34mmol)，kf(40mg，0.69mmol)，diea(219mg，1.7mmol)，dmso(5ml)，升温到90℃反应2小时。反应完成后，加h2o稀释，etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩。所得余物柱层析纯化(pe∶etoac(v/v)＝1∶1)得固体50mg，产率36％。lcms(esi):m/z＝409(m+h)+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.67(s,1h),8.10-7.98(m,2h),7.68-7.54(m,2h),7.42–7.28(m,2h),5.54(d,j＝6.0hz,1h),5.41(s,2h),5.22-5.10(m,1h),1.57(d,j＝7.1hz,3h).
实施例5.
(s)-2-氨基-4-((1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙基)氨基)-6-甲基嘧啶-5-甲腈
步骤1.4-氯-5-碘-6-甲基嘧啶-2-胺
于一100ml圆底烧瓶中，4-氯-6-甲基嘧啶-2-胺(3g，21.0mmol)溶于40ml冰乙酸中，置于冰浴中冷却至低于10℃。往上溶液加入nis(2.4g，10.6mmol)，反应1小时后再加入nis(2.4g，10.6mmol)，反应1小时后自然升至室温反应8小时。反应完成后，将反应液倒到冰水中，以etoac萃取，有机相依次以5％na2so3溶液、10％nahco3溶液和饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后减压浓缩除去溶剂，得到4.9g固体，即为标题化合物，产率87％，lcms(esi):m/z＝270(m+h)+。
步骤2.2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶-5-甲腈
于一150ml圆底烧瓶中，氮气保护下，加入4-氯-5-碘-6-甲基嘧啶-2-胺(4.9g，18.2mmol)，zn(cn)2(4.3g，36.6mmol)，pd(pph3)4(2.1g，1.8mmol)，cui(1.7g，8.9mmol)和dmf(60ml)，加热到80℃反应16小时。反应完成后，以etoac稀释，经硅藻土过滤，滤渣以etoac洗涤。所得滤液加h2o，以etoac萃取，有机相以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩，所得余物柱层析纯化(pe∶etoac(v/v)＝5∶1)得固体1.1g，产率36％。lcms(esi):m/z＝169(m+h)+。
步骤3.(s)-2-氨基-4-((1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙基)氨基)-6-甲基嘧啶-5-甲腈
于25ml圆底烧瓶中，加入(s)-1-(3-氯-5-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶-6-基)乙胺(100mg，0.37mmol)，2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶-5-甲腈(62mg，0.37mmol)，kf(43mg，0.74mmol)，diea(232mg，1.8mmol)，dmso(5ml)，升温到90℃反应2小时。反应完成后，加h2o稀释，etoac萃取，合并有机相，以饱和nacl溶液洗涤，无水na2so4干燥，过滤后浓缩。所得余物柱层析纯化(pe∶etoac(v/v)＝1∶1)得固体102mg，产率68％。lcms(esi):m/z＝405(m+h)+。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.70(s,1h),8.03(s,1h),7.79–7.31(m,5h),5.76(d,j＝6.7hz,1h),5.66–4.71(m,3h),2.39(s,3h),1.63(d,j＝7.1hz,3h).
本发明的化合物用于调节激酶活性以及抑制细胞增殖通过以下描述的方案进行实验。
实施例a:pi3k激酶活性测定
用adp-glo方法测试pi3k的激酶活性。adp-glo来自于promega(#v9101)。p110/p85来自于millipore(#14-604-k)。每个化合物通过测定10个浓度点来评估化合物的ic50，其起始浓度为1m，然后进行3倍的系列稀释。测试缓冲液是50mmhepesph7.5,3mmmgcl2,1mmegta,100mmnacl,0.03％chaps,2mmdtt。最终激酶浓度是pi3k17nm，最终pip2浓度为50m，最终atp浓度为25m。
1.制备10l的激酶反应溶液：往一个384孔板(corning#4512)的反应孔中加入2.5l测试化合物溶液，2.5l激酶溶液，5l底物溶液。
2.将384孔板盖上盖子，于室温下孵育60分钟。
3.从每个反应孔中转移5l反应液到一块新的384孔板的反应孔中。
4.加入5ladp-glo试剂到384孔板反应孔中终止反应。
5.在振板机上轻轻震荡40分钟。
6.加入10l激酶检测试剂到每个反应孔中，震荡1分钟，室温静置30分钟。
8.用synegy读取样品发光值。
9.用excel对数据进行处理，用xlfit软件进行曲线拟合得到每个化合物的ic50值(表1)。
实施例b.化合物的细胞抑制活性检测
用celltiter-glo法检测化合物对淋巴瘤细胞su-dhl-6(atcc，目录号：crl-2959)增殖的抑制。实验使用的细胞培养液是rpmi1640(invitrogen,目录号：11875-093)。实验使用了10％胎牛血清(invitrogen，目录号：10099-141)。
含有15000个细胞的100微升培养液被分配到96孔培养板(corning#3903)的孔中，放置于二氧化碳培养箱中培养过夜。第二天每孔加入0.5微升的待测化合物(用dmso配置成8个连续的浓度梯度)，每个浓度设两个重复，并设无细胞孔(空白对照)和dmso孔(溶剂对照)。加药后将细胞在37度、5％二氧化碳的条件下继续培养72小时。最后每孔加入100微升celltiter-glo试剂(promega，目录号：g7571)，用flexstation3(moleculardevices)检测发光信号，用xlfit软件计算化合物对细胞增殖抑制的ic50值(表1)。
表1.化合物的激酶活性和细胞活性
a:<20nm；b:20-100nm；c:>100-1000nm
由表1结果可以看出，本发明化合物对pi3k有很好的激酶抑制活性。本发明化合物也能有效地抑制淋巴瘤细胞的增长。