本发明属于dna检测技术领域，涉及一种线粒体基因组dna快速分离、测序新方法及试剂盒。
背景技术：
绝大多数真核生物都有线粒体，线粒体是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为生物发动机。线粒体拥有自身的遗传物质和遗传系统，但其基因组较小，是一种半自主细胞器。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。动物的线粒体序列缺陷会引起很严重的疾病，而且线粒体基因组序列被广泛用于研究物种进化。
线粒体基因组序列比较难得到，以前研究线粒体基因组序列的方法有三种：1、在检测全基因组序列的时候，顺便检测染色体基因组序列；这样需要的经费就比较大，而且在数据覆盖度不够大的情况下，线粒体序列也不一定能检测完全。从其他高通量数据间接得到线粒体基因组信息的方法存在一个重要问题即numts的污染。numts专指生物体线粒体基因组起源的核序列，是由线粒体基因组转移到核基因组形成的细胞核numts，在脊椎动物和无脊椎动物中广泛存在，具有序列长、拷贝数高的特点。由于numts与线粒体基因组的序列近似或完全匹配，因此容易将转入核基因组的numts错误分析成线粒体基因组的序列，造成生物多样性、种群遗传、物种系统进化关系和线粒体疾病的错误研究和推断。2、用超速离心机分离线粒体，提取dna检测；这样做的缺点是需要很大的组织样本，前期实验过程比较繁琐。3、设计覆盖全线粒体基因组的引物，通过pcr得到线粒体序列，测序；这样做的缺点是不能检测还未知的线粒体序列，引物设计费用比较大，pcr容易带入突变影响测序结果,总有一些区域不能被检测到。
本发明采用核酸外切酶iii或plasmid-safeatp-dependentdnase酶降解线性染色体序列，进而富集线粒体基因组dna用于高通量测序。核酸外切酶iii或plasmid-safeatp-dependentdnase酶可以作用于双链dna，沿3’到5’方向逐步催化去除单核苷酸。核酸外切酶iii一般应用于单向巢式缺失，定点突变，链特异性探针的制备，双脱氧测序用单链底物制备。plasmid-safeatp-dependentdnase酶目前一般用于消化环化质粒dna中混入的线性基因组dna；或者消化乙肝病人的血液dna，富集环化的乙肝病毒dna，增加检测灵敏度。这两种酶都还未有报道用于真核生物线粒体dna的富集。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于非诊断目的的分离检测线粒体基因组dna的方法。
本发明步骤包括:
步骤(1)、提取生物组织样品或血液样品总dna，其中生物组织样品可以是动物,植物,真菌；
步骤(2)、分离富集线粒体dna：
将步骤(1)提取的基因组dna,加入核酸外切酶iii(exonucleaseiii)或plasmid-safeatp-dependentdnase酶，以及相应的反应缓冲液，37℃，0.5-16小时,磁珠回收纯化dna,回收的核酸中绝大部分线性dna被消化，线粒体dna含量比例升高。
步骤(1)提取的基因组dna与核酸外切酶iii或plasmid-safeatp-dependentdnase酶的质量体积比为(1-3)ug：(1-3)ul；
步骤(3)、线粒体基因组dna测序：
取步骤(2)中分离的(0.001-1)ug线粒体dna，构建200bp短片段文库，或者取步骤(2)中分离的(1-3)ug线粒体dna，构建3kbmate-pair文库；用高通量测序仪，得到100m以上的数据，拼接后得到线粒体基因组完成序列。
本发明的另一个目的是提供线粒体基因组dna检测试剂盒。
该试剂盒包括核酸外切酶iii(exonucleaseiii)或plasmid-safeatp-dependentdnase酶，以及反应缓冲液；可以搭配文库构建试剂使用。
本发明线粒体dna测序方法为线粒体基因组的检测,特别是可以针对没有参照序列的线粒体基因组检测。
本发明试剂盒可以通过少量血液检测线粒体病，基于线粒体dna的物种进化分析等研究提供了简便快速低成本的技术方法。
核酸外切酶iii(exonucleaseiii)或plasmid-safeatp-dependentdnase酶在弱碱性条件下，消化线性双链dna为脱氧核苷酸。但对于环状或双链dna超螺旋dna没有活性。将该酶用于总dna的消化,就可以除去线性染色体dna,富集环状的线粒体基因组dna。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明线粒体基因组dna快速分离、测序新方法，包括以下步骤:
步骤(1)、提取生物组织样品总dna：
取200ug左右的生物组织样品(动物,植物,真菌),放入研钵,液氮冷冻,研磨成粉状,反复冷冻研磨2-3次,看不到块状组织为止；加入1-3mlplantdnazol,继续研磨混匀；溶解后将液体转入2毫升离心管，放到60℃金属浴加热15-60分钟，期间多次颠倒混匀；高速离心3分钟；上清液转移到新1.5毫升离心管，加入等体积氯仿，最高速离心3分钟；上层液体转移到新1.5毫升离心管，加60％异丙醇，颠倒混匀，最高速离心15分钟；弃上清，加1毫升70％酒精，颠倒混匀，最高速离心1分钟；弃上清，晾干，加100微升te溶液，溶解总dna。采用试剂盒用膜吸附或者磁珠吸附的方法提取的总dna也都可以用。
步骤(2)、分离富集线粒体dna：
将步骤(1)提取的基因组dna,加入核酸外切酶iii(exonucleaseiii)或plasmid-safeatp-dependentdnase酶，以及相应的反应缓冲液，37℃，0.5-16小时,磁珠回收纯化dna,回收的核酸中绝大部分线性dna被消化，线粒体dna含量比例升高。
步骤(1)提取的基因组dna与核酸外切酶iii或plasmid-safeatp-dependentdnase酶的质量体积比为1-3ug：1-3ul；
步骤(3)、线粒体基因组dna测序：
取步骤(2)中分离的0.001ug-1ug线粒体dna，构建200bp短片段文库，或者取步骤(2)中分离的0.001ug-3ug线粒体dna构建3kbmate-pair文库，用高通量测序仪，得到100m以上的数据，拼接后就能得到线粒体基因组完成序列。
线粒体基因组dna检测试剂盒，包括核酸外切酶iii(exonucleaseiii)或plasmid-safeatp-dependentdnase酶，以及反应缓冲液；
实施例1
1)取10mg拟南芥新鲜样本，利用基因组试剂盒或者液氮研磨，氯仿去除蛋白，异丙醇沉淀的方法提取总基因组dna，加水溶解。
2)取2ug的总dna，加1微升plasmid-safeatp-dependentdnase酶,2微升10*buffer，0.8微升10毫摩尔atp，加水补足到20微升体系，37度，反应1-3小时。
3)在反应体系中加入30微升超纯水，加40微升ampxp磁珠，混匀，吸附没有被降解的dna，用70％的酒精洗两次，晾干3分钟，加20微升超纯水溶解dna。
4)取100ng经过plasmid-safeatp-dependentdnase酶处理的dna，利用ionpgmtmtemplateot2200kit构建200bp文库，用iontorrent个人化操作基因组测序仪(pgmtm)检测dna序列，得到9m数据。
5)利用clcgenomicsworkbench分析软件，去除低质量序列，拼接结果可以看到拟南芥线粒体基因组被覆盖了1.15倍。
实施例2
1)取10mg猪肉冰冻样本，利用液氮研磨，氯仿去除蛋白，异丙醇沉淀dna的方法提取总基因组dna，加水溶解。
2)取1ug的总dna，加1微升plasmid-safeatp-dependentdnase酶,2微升10*buffer，0.8微升10毫摩尔atp，加水补足到20微升体系，37度，过夜反应12小时。
3)在反应体系中加入30微升超纯水，加40微升ampxp磁珠，混匀，吸附没有被降解的dna，用70％的酒精洗两次，晾干3分钟，加20微升超纯水溶解dna。
4)利用ionpgmtmtemplateot2200kit构建200bp文库，用iontorrent个人化操作基因组测序仪(pgmtm)检测dna序列，得到17m数据。
5)利用clcgenomicsworkbench分析软件，去除低质量序列，拼接结果可以看到猪线粒体基因组被覆盖了10倍。
实施例3
1)高速离心10毫升取酵母过夜培养液，弃上清，用液氮研磨，异丙醇沉淀的方法提取总基因组dna，加水溶解。
2)取3ug的总dna，加3微升exonucleaseiii酶,2微升10*buffer，加水补足到20微升体系，37度，反应0.5小时。
3)在反应体系中加入30微升超纯水，加40微升ampxp磁珠，混匀，吸附没有被降解的dna，用70％的酒精洗两次，晾干3分钟，加20微升超纯水溶解dna。
4)取100ng经过exonucleaseiii酶处理的dna，利用ionpgmtmtemplateot2200kit构建200bp文库，用iontorrent个人化操作基因组测序仪(pgmtm)检测dna序列，得到7.5m数据。
5)利用clcgenomicsworkbench分析软件，去除低质量序列，拼接结果可以看到拟南芥线粒体基因组被覆盖了0.73倍。
实施案例4
1)取3ml新鲜静脉血，用血液基因组提取试剂盒提取总基因组dna，加水溶解。
2)取2ug的总dna，加1微升plasmid-safeatp-dependentdnase酶,2微升10*buffer，0.8微升10毫摩尔atp，加水补足到20微升体系，37度，反应3小时。
3)在反应体系中加入30微升超纯水，加40微升ampxp磁珠，混匀，吸附没有被降解的dna，用70％的酒精洗两次，晾干3分钟，加20微升超纯水溶解dna。
4)取50ng经过plasmid-safeatp-dependentdnase酶处理的dna，利用trueprepdnalibraryprepkitv2试剂盒构建300bp文库，用illmina测序仪检测dna序列，得到500m数据。
5)利用clcgenomicsworkbench分析软件，去除低质量序列，拼接结果可以看到人线粒体基因组被覆盖了64倍。
6)可以通过与已知的参考序列比对，查找确认突变位点。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。