本发明涉及一种具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分的制备及其应用。具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的活性组分，可用于治疗或预防神经退行性疾病如阿尔茨海默症等认知障碍疾病。
背景技术：
鹿茸是鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿密生绒毛的未骨化幼角，始载于汉代的《神农本草经》，入药已有2000多年的历史，其后在历代药学典籍中对鹿茸的药用均有收载。鹿茸具有包含抗衰老、增强中枢神经系统等许多药理作用(chinesetraditionalandherbaldrugs.2007,38(8),1163-1167)。
ht-22细胞是小鼠海马原代神经元永生化而得的细胞系，可以较理想地模拟与海马神经元相关疾病的体外细胞模型，广泛应用于与神经元相关疾病的研究。谷氨酸是脑与脊髓中含量最丰富的内源性兴奋型神经递质，但当其胞外浓度过高时会直接引发谷氨酸转运体的谷氨酸摄取功能饱和，引发一系列的神经系统紊乱。且谷氨酸在许多神经与精神疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症等疾病中发挥着重要的传递作用。因此，利用谷氨酸诱导ht-22细胞建立细胞损伤模型，可用于研究考察鹿茸活性组分对于阿尔茨海默病的潜在治疗作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分及其应用。鹿茸经蛋白酶酶解，产物具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用，可作为改善阿尔茨海默症等认知障碍疾病药物研发的潜在来源。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分的制备方法，将鹿茸提取、酶解、纯化，得到一种具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分；
具体过程如下：
1)新鲜鹿茸切碎后冷冻干燥，粉碎，加入鹿茸质量5～30倍(最优范围为10～20倍)的去离子水，升温至30～70℃(最优范围为40～55℃)后加入鹿茸质量0.1～2.0％(w/w)的蛋白酶a，搅拌提取1～5小时(最优范围为2～4)，提取结束后冷却至室温，以2500×g～15000×g于2～8℃离心5～30min，保留上清液；
2)用1～6m的盐酸将提取物的ph调至1.0～5.0(最优范围为3.0～4.0)，搅拌均匀后加入鹿茸质量0.1～5.0％(w/w)(最优范围为2.0～3.0％)的蛋白酶b，在20～65℃(最优范围为30～50℃)温度下酶解0.5～24小时(最优范围为3～10小时)；酶解结束后用1～6m的naoh溶液将ph调节至6.0～8.0(最优范围为6.5～7.5)，再加入鹿茸质量0.1～5.0％(w/w)(最优范围为2.0～3.0％)的蛋白酶c，在20～65℃(最优范围为30～50℃)温度下酶解0.5～24小时(最优范围为3～10小时)，反应结束后将温度升至90～100℃(最优范围为95～100℃)并保温10～30分钟后冷却至室温；
3)酶解液以2500×g～10000×g的速度于2～8℃离心5～30分钟，上清液加水稀释至15～50mg/ml待用。将溶胀后的sephadexg-25填料填装成直径1.4～10.0cm、柱高与直径比5:1～10:1的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速0.03～10l/h进行洗脱，收集流份并在205nm检测吸光度。检测各流份的pep(脯氨酰内切酶)抑制活性，将pep抑制活性最高的流份冷冻干燥，得到具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的组分。
所述蛋白酶a为碱性蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶中的一种或二种以上组合；蛋白酶b为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或二种以上组合；蛋白酶c为菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或二种以上组合。且蛋白酶a、蛋白酶b和蛋白酶c均不能相同，即蛋白酶a、蛋白酶b和蛋白酶c所采用的蛋白酶不同或所采用的组合蛋白酶中的蛋白酶不同。
所制备的活性组分含有lhvdpen、fpsivgrp、fphfdlshgsa、pgpmgprgap两种或两种以上的抗氧化肽(筛选这4条肽的原则：含有较多的富电子集团(如芳香族基团、吡咯环、咪唑环)残基、含有较多的疏水性基团、n端为疏水性氨基酸残基、c端第二位含有易形成氢键的基团)。
所述制备方法获得的具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分。
所述具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分，可用于制备治疗和/或预防神经系统疾病的药物及保健食品。
所述神经系统疾病为神经性退化性疾病。
所述疾病为阿尔兹海默症或帕金森症等认知障碍疾病。
本发明建立了一种具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的鹿茸活性组分的制备方法，所制备的鹿茸活性组分可应用于阿尔茨海默症等认知障碍疾病的预防和治疗，具有广阔的应用前景。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
1.使用本方法所制备的鹿茸活性组分提取率高、条件温和，对鹿茸中原有的活性组分保留较好。该方法简便可行，对环境友好，可用于大规模生产。
2.通过建立氧化应激损伤细胞模型考察与验证组分的活性，为其治疗认知障碍性疾病的潜在作用奠定药理学基础。
3.具有良好的应用前景。本发明作为认知障碍疾病药物或保健食品研发的潜在来源具有广泛的应用前景。
具体实施方式
实施例1
1.以新鲜梅花鹿鹿茸为原料，按照以下工艺制备：
新鲜鹿茸冷冻干燥粉碎后取1kg粉末，加入5l去离子水，升温至45℃，加入2.5g胰蛋白酶搅拌5小时后冷却至室温，以5000×g离心10分钟，保留上清液。用1m的盐酸将上清液的ph调至4.0，搅拌均匀后加入1g胃蛋白酶，在37℃温度下酶解2小时；酶解结束后用1m的naoh溶液将ph调节至7.0，再加入0.5g胰凝乳蛋白酶与0.5g胰蛋白酶，37℃酶解2小时，反应结束后将温度升至90℃并保温10分钟后冷却至室温。
酶解液以5000×g的速度于4℃离心10分钟，上清液加水稀释至40mg/ml待用。将溶胀后的sephadexg-25填料填装成直径10.0cm、柱高100cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速10l/h进行洗脱，收集流份并在205nm检测吸光度。检测各流份的pep(脯氨酰内切酶)抑制活性，将pep抑制活性最高的流份冷冻干燥，得到具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的组分。
2.对获得的鹿茸组分进行抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的活性检测：
1)方法
(1)细胞培养：所选用的细胞为ht-22细胞系。将细胞置于含有0.1mg/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素和10％(v/v)fbs的dmem高糖型培养基中，37℃5％co2培养。当细胞铺满培养皿底部70％进行传代。每2天更换一次培养液。
(2)谷氨酸诱导的氧化应激损伤模型的建立：将对数生长期的ht-22细胞用0.25％胰蛋白酶消化，加入适当体积的含10％fbs的dmem培养基混匀，1000×g离心后弃去上清，沉淀用5％fbs的dmem稀释成约5×104cfu/ml的悬液，按表一向96孔板的各孔中加入相应溶液后在37℃湿润的5％co2培养箱中进行培养，最后测定细胞活力。
表一谷氨酸诱导的氧化应激损伤模型的分组与体系
表一中：
细胞悬液：用含5％fbs的dmem培养基分散的浓度5×104cfu/ml的ht-22细胞悬液。
pbs：磷酸盐缓冲水溶液(每1l含0.20gkcl、0.24gkh2po4、8.00gnacl、1.44gna2hpo4，ph＝7.4)
样品溶液：用pbs将鹿茸活性组分稀释若干倍，过0.22μm无菌滤膜，滤液经nanodroponec(thermofisher公司)测定肽浓度(肽浓度＝a205/31，mg/ml)。
谷氨酸钠溶液：140mg谷氨酸钠加双蒸水定容至10ml，过0.22μm滤膜。模型体系中的谷氨酸钠浓度为5mm。
细胞活力按碧云天beyotime公司的wst-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒进行测定，细胞活力计算公式为：(a样品组-a模型组)/(a正常组-a模型组)×型组活力。
2)检测结果
以细胞活力为指标衡量活性提取物对损伤模型细胞的保护作用，结果如表二所示。
表二活性提取物抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用实验结果
3.对获得的鹿茸组分进行pep抑制活性检测
1)原理
pep能够特异性地在脯氨酸的羧基末端水解小分子量多肽。因此本方法采用z-gly-pro-4-nitroanilide作为pep的底物，z-gly-pro-4-nitroanilide被pep切下z-gly-pro后，生成黄色的对硝基苯胺在405nm有特征吸收峰，根据加入样品和底物前后的405nm下的吸光度变化，可以计算样品对于pep的抑制活性。
2)方法
样品：将样品溶解于10mm的pbs缓冲液(ph＝7.0)，按实验需要分别配制成0.5、1.0和2.0mg/ml浓度的溶液。
底物溶液：z-gly-pro-4-nitroanilide(z-gly-pro-pna)溶液，z-gly-pro-4-nitroanilide用40％(v/v)的二氧六环配制成10mm的溶液。
阳性药物：丙戊酸钠(sodiumvalproate)溶液，丙戊酸钠溶于10mm的pbs(ph＝7.0)，按实验需要将其分别配制成0.2、0.4、1.0、2.0和4.0mm浓度的溶液。
酶溶液：pep溶液，将pep用保护液(45mmtris-hcl，ph8.0，124mmnacl，2.4mmkcl，10％(v/v)甘油，225mm咪唑和3mmdtt)稀释成1u/ml的溶液分装储存于-80℃冰箱，临用前用pbs(10mmpbs，137mmnacl和2.7mmkcl，ph7.0)稀释8倍，作为pep溶液。
实验在96孔板中进行，利用酶标仪在405nm检测吸光度。首先将140μlpbs，20μl样品(或缓冲液)和20μlpep酶溶液依次加入到样品孔中，37℃孵育5min后，再加入20μl底物，混匀后于37℃温育30分钟，用酶标仪测定405nm吸光度。反应总体积为200μl。每孔做三个平行，计算样品抑制率。
表三pep抑制活性实验分组及加样量
抑制率计算公式：
其中i表示抑制率，asample表示样品吸光度值，asampleblank表示样品空白吸光度值，acontrol表示阴性对照组吸光度值，ablank表示空白组吸光度值。
3)检测结果
以丙戊酸钠为阳性对照药物，按上述方法分别检测体系浓度为0.2、0.4、1、2和4mm时的pep抑制率，结果如表四所示：
表四丙戊酸钠pep抑制率
由表二可知丙戊酸钠的ic50为1.98mm。
以鹿茸活性组分样品代替丙戊酸钠同法操作。当鹿茸活性组分样品浓度为4.0和2.0mg/ml时，pep抑制率分别为78.5和66.3％
4.对获得的鹿茸组分进行抗氧化活性检测
abts经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基abts·+，抗氧化成分会与abts·+发生反应而使反应体系褪色，因此可在其最大吸光波长734nm下检测吸光度的变化从而考察样品抗氧化活性强弱。将样品与含抗坏血酸的对照标准体系比较,换算出被测物质抗氧化能力。
配置含8mmabts(m＝548.68)、3mmk2s2o8的溶液，室温避光静置16h。用0.1mpbs(ph＝7.4，含0.15mmnacl)将abts·+溶液的od730nm稀释至1.5，按表五配置反应溶液，室温遮光反应30min，
表五abts·+清除活性实验体系
注：“—”为对应体积的蒸馏水
5μg/ml抗环血酸的abts·+清除率为48％，50％g/ml活性提取物abts·+清除率为56％。
5.获得的鹿茸组分的肽组成
将样品用0.1％甲酸水溶液复溶，取4μg样品经ltqorbitrapvelos(线性离子阱回旋共振组合色谱仪)和mascot2.5.1数据处理软件分析，得到如下肽段。
表六鹿茸组分的肽组成
实施例2
以新鲜梅花鹿鹿茸为原料，按照以下工艺制备：
新鲜鹿茸冷冻干燥粉碎后取1kg粉末，加入15l去离子水，升温至55℃，加入2g木瓜蛋白酶搅拌3小时后冷却至室温，以3500×g离心10分钟，保留上清液。用2m的盐酸将上清液的ph调至5.5，搅拌均匀后加入1g菠萝蛋白酶，在45℃温度下酶解2小时；酶解结束后用1m的naoh溶液将ph调节至7.0，再加入1.0g中性蛋白酶，37℃酶解2小时，反应结束后将温度升至90℃并保温10分钟后冷却至室温。
酶解液以3500×g的速度于4℃离心15分钟，上清液加水稀释至25mg/ml待用。将溶胀后的sephadexg-25填料填装成直径10.0cm、柱高100cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速10l/h进行洗脱，收集流份并在205nm检测吸光度。检测各流份的pep(脯氨酰内切酶)抑制活性，将pep抑制活性最高的流份冷冻干燥，得到具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的组分。
2.对获得的鹿茸组分进行抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的活性检测：鹿茸活性组分浓度为500、200性g/ml时，细胞活力百分比分别为41.8％、14.4％。
3.对获得的鹿茸组分进行pep抑制活性检测：鹿茸活性组分样品浓度为4.0、2.0mg/ml时，pep抑制率分别为66.3％、58.2％。
4.对获得的鹿茸组分进行抗氧化活性检测：50茸g/ml活性提取物abts·+清除率为52％。
实施例3
以新鲜梅花鹿鹿茸为原料，按照以下工艺制备：
新鲜鹿茸冷冻干燥粉碎后取1kg粉末，加入20l去离子水，升温至45℃，加入2g菠萝蛋白酶搅拌3小时后冷却至室温，以10000×g离心10分钟，保留上清液。用2m的盐酸将上清液的ph调至3.5，搅拌均匀后加入1g胃蛋白酶，在37℃温度下酶解2小时；酶解结束后用4m的naoh溶液将ph调节至7.0，再加入0.5g风味蛋白酶和1.0g碱性蛋白酶，50℃酶解2小时，反应结束后将温度升至90℃并保温15分钟后冷却至室温。
酶解液以3500×g的速度于4℃离心15分钟，上清液加水稀释至20mg/ml待用。将溶胀后的sephadexg-25填料填装成直径10.0cm、柱高100cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速10l/h进行洗脱，收集流份并在205nm检测吸光度。检测各流份的pep(脯氨酰内切酶)抑制活性，将pep抑制活性最高的流份冷冻干燥，得到具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的组分。
2.对获得的鹿茸组分进行抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的活性检测：鹿茸活性组分浓度为1000、200活g/ml时，细胞活力百分比分别为100.0％、74.9％。
3.对获得的鹿茸组分进行pep抑制活性检测：鹿茸活性组分样品浓度为4.0、2.0mg/ml时，pep抑制率分别为73.1％、53.2％。
4.对获得的鹿茸组分进行抗氧化活性检测：50茸g/ml活性提取物abts·+清除率为56.9％。
实施例4
以新鲜梅花鹿鹿茸为原料，按照以下工艺制备：
新鲜鹿茸冷冻干燥粉碎后取1kg粉末，加入20l去离子水，升温至50℃，加入2g胰凝乳蛋白酶搅拌5小时后冷却至室温，以3000×g离心10分钟，保留上清液。用2m的盐酸将上清液的ph调至4.0，搅拌均匀后加入1g胃蛋白酶，在40℃温度下酶解2小时；酶解结束后用4m的naoh溶液将ph调节至7.0，再加入1.0g碱性蛋白酶，50℃酶解2小时，反应结束后将温度升至90℃并保温15分钟后冷却至室温。
酶解液以3500×g的速度于4℃离心15分钟，上清液加水稀释至20mg/ml待用。将溶胀后的sephadexg-25填料填装成直径10.0cm、柱高100cm的凝胶柱。将酶解液加载于凝胶柱上，以去离子水为洗脱液、流速10l/h进行洗脱，收集流份并在205nm检测吸光度。检测各流份的pep(脯氨酰内切酶)抑制活性，将pep抑制活性最高的流份冷冻干燥，得到具有抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的组分。
2.对获得的鹿茸组分进行抗谷氨酸诱导ht-22细胞氧化应激损伤作用的活性检测：鹿茸活性组分浓度为80、20为g/ml时，细胞活力百分比分别为127.6％、71.3％。
3.对获得的鹿茸组分进行pep抑制活性检测：鹿茸活性组分样品浓度为4.0、2.0mg/ml时，pep抑制率分别为68.0％、44.4％。
4.对获得的鹿茸组分进行抗氧化活性检测：50茸g/ml活性提取物abts·+清除率为50.7％。