本发明涉及一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法，特别涉及一种射频技术辅助蚓激酶提取和蚯蚓蛋白酶解的方法。
背景技术：
蚯蚓又名地龙，富含蛋白质、氨基酸、微量元素、酶、激素等功能性成份，蚯蚓干蛋白质含量达到70％，是制备药品、化妆品、保健食品等的原料，具有很大的经济价值。蚓激酶是一种具有激酶和纤溶酶活性的丝氨酸蛋白水解酶，可以作为治疗血栓类疾病的药物，是国家批准的预防和治疗心脑血管疾病的二类新药，是目前最具有价值的纤溶药物之一。
射频(简称rf)是一种高频交流电磁波，其频率范围为3khz～300mhz。早在20世纪，射频技术在国外就已经应用于加热肉制品、面包和生产脱水蔬菜，冷冻食品的解冻处理和食品杀菌等领域，射频技术在我国也早有应用，但其应用仅限于工业和医疗，在食品领域应用甚少。利用射频技术的变化电磁波系统提高蚯蚓蛋白提取效率，刺激蚯蚓因激酶的分泌，从而实现蚯蚓激酶和短链多肽的工业化生产。
蚓激酶的提纯方法通常是单一品种盐析，然后通过多种层析，及hplc、fplc乃至亲和层析或deae离子交换层析、分子筛、凝胶电泳等手段，从不同品系的蚯蚓中获得多种纤溶酶单纯组分，但操作复杂，流程长，处理量小，且酶活力损失很大，又不适合工业化生产。
考虑到蚓激酶是多种有活性组分组成，所以在提取时采用更适合工业化生产的工艺，选择具有生物活性蛋白的分子量空间进行分离，本发明以工业化生产为目的，选择切实可行的工艺路线，可以特异性地从蚯蚓匀浆液中一条线获得蚓激酶、超氧化物歧化酶、其他酶类、蚯蚓多肽，简单易行，提取物有效成分高，适合大规模生产。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明旨在提供一种蚯蚓蛋白和蚓激酶提取的方法，该方法具有反应效率高、反应条件可控，同时射频技术的应用可实现灭菌机制，增强酶活酶解速率。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明采用射频技术作为蚓激酶和蚯蚓蛋白提取的辅助技术，在蚯蚓中提取分离蚯蚓蛋白、蚓激酶以及酶解多肽，具体实施步骤如下：(1)取新鲜饱满活蚯蚓，水洗数次，尽最大可能使其内脏中的污物排出，然后捞出用滤纸尽量吸其多余水分；
(2)加入4℃预冷的0.1mol/lph7.8的磷酸缓冲液于匀浆器中匀浆5分钟，在4℃冰箱中静置4小时，后高速离心，弃去沉淀，得上清液；
(3)取上清液加固体硫酸铵达35％饱和度，4000r/min，离心10min，收集上清液，再加入固体硫酸铵达70％饱和度，静置过夜，高速离心，收集沉淀，后用0.1mol/l磷酸缓冲液溶解此沉淀物，过滤得粗蛋白溶液；
(4)将粗蛋白溶液加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(ph7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥5‐20小时，即得蚯蚓蛋白冻干粉；
(5)将蚯蚓蛋白冻干粉加入0.1mol/lph7.8的磷酸缓冲液溶解，两端过20000da‐40000da超滤膜，得截留液a和滤过液b；
(6)将截留液a加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(ph7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥5‐20小时，得到冻干蚓激酶；
(7)将步骤(3)所得粗蛋白溶液加入蛋白酶酶解，采用射频辅助酶解，过6000da超滤膜，将滤过液加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(ph7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥5‐20小时，得到6500da类泛素蚯蚓多肽。
所述步骤(2)中磷酸缓冲液还可以加入0.1％‐0.5％的氯化钠或柠檬酸钠或磷酸氢二钠或碳酸氢钠或碳酸钠水溶液。
所述步骤(3)中高速离心采用转速15000～25000r/min，卧式螺旋离心机。
所述步骤(5)超滤膜还可以是透析袋，透析液为0.02mol/l磷酸缓冲液。
所述步骤(5)中色谱柱填料为葡聚糖或琼脂糖中的一种。
所述步骤(7)中蛋白酶是指中性蛋白酶和胰蛋白酶。
所述蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法辅助条件为频率10mhz‐200mhz的射频系统。
相对于现有技术，本发明所述的一种蚯蚓中蚯蚓蛋白和蚓激酶的提取方法，具有以下优势：
磷酸缓冲液中加入低浓度钠盐，采用分步盐析法，可提高盐析速率和蛋白质得率。
超滤法或透析法中蛋白损失率高，采用射频辅助可提高蛋白质分子透过率，减少分子损失和酶活的降低。
蚓激酶和蚯蚓蛋白的提取过程可实现蛋白无菌机制，防止蛋白酶染菌变质，产品质量更优。
具体实施方式
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
(1)取新鲜饱满活蚯蚓，水洗数次，尽最大可能使其内脏中的污物排出，然后捞出用滤纸尽量吸其多余水分，置于射频系统中处理30min，射频频率为100mhz，温度为37℃；
(2)加入4℃预冷的0.1mol/lph7.8的磷酸缓冲液和0.2％的氯化钠水溶液于匀浆器中匀浆5分钟，在4℃冰箱中静置4小时，后离心，弃去沉淀，得上清液；
(3)取上清液加固体硫酸铵达35％饱和度，4000r/min，离心10min，收集上清液，再加入固体硫酸铵达70％饱和度，静置过夜，15000r/min离心，收集沉淀，后用0.1mol/l磷酸缓冲液溶解此沉淀物，过滤得粗蛋白溶液。
(4)将粗蛋白溶液加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(ph7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥10小时，即得蚯蚓蛋白冻干粉。
实施例2
(1)取新鲜饱满活蚯蚓，水洗数次，尽最大可能使其内脏中的污物排出，然后捞出用滤纸尽量吸其多余水分，置于射频系统中处理30min，射频频率为150mhz，温度为40℃；
(2)加入4℃预冷的0.1mol/lph7.8的磷酸缓冲液和0.2％柠檬酸钠水溶液于匀浆器中匀浆5分钟，在4℃冰箱中静置4小时，后高速离心，弃去沉淀，得上清液；
(3)取上清液加固体硫酸铵达35％饱和度，4000r/min，离心10min，收集上清液，再加入固体硫酸铵达70％饱和度，静置过夜，20000r/min离心，收集沉淀，后用0.1mol/l磷酸缓冲液溶解此沉淀物，过滤得粗蛋白溶液。
(4)将粗蛋白溶液加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(ph7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥15小时，即得蚯蚓蛋白冻干粉。
(5)将蚯蚓蛋白冻干粉加入4℃预冷的0.1mol/lph7.8的磷酸缓冲液，过葡聚糖柱，两端过20000da‐40000da超滤膜，得截留液a和滤过液b。
(6)将截留液a加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(ph7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥15小时，得到冻干蚓激酶。
实施例3
(1)取新鲜饱满活蚯蚓，水洗数次，尽最大可能使其内脏中的污物排出，然后捞出用滤纸尽量吸其多余水分，置于射频系统中处理30min，射频频率为200mhz，温度为50℃；
(2)加入4℃预冷的0.1mol/lph7.8的磷酸缓冲液和0.2％的磷酸氢二钠水溶液于匀浆器中匀浆5分钟，在4℃冰箱中静置4小时，后高速离心，弃去沉淀，得上清液；
(3)取上清液加固体硫酸铵达35％饱和度，4000r/min，离心10min，收集上清液，再加入固体硫酸铵达70％饱和度，静置过夜，25000r/min离心，收集沉淀，后用0.1mol/l磷酸缓冲液溶解此沉淀物，过滤得粗蛋白溶液。
(4)将粗蛋白溶液加入中性蛋白酶和胰蛋白酶，置于150mhz射频系统中，过7000da透析袋，得到6500da蚯蚓多肽。
实施例4
(1)取新鲜饱满活蚯蚓，水洗数次，尽最大可能使其内脏中的污物排出，然后捞出用滤纸尽量吸其多余水分，置于射频系统中处理30min，射频频率为30mhz，温度为40℃；
(2)加入4℃预冷的0.1mol/lph7.8的磷酸缓冲液和0.2％柠檬酸钠水溶液于匀浆器中匀浆5分钟，在4℃冰箱中静置4小时，后高速离心，弃去沉淀，得上清液；
(3)取上清液加固体硫酸铵达35％饱和度，4000r/min，离心10min，收集上清液，再加入固体硫酸铵达70％饱和度，静置过夜，25000r/min离心，收集沉淀，后用0.1mol/l磷酸缓冲液溶解此沉淀物，过滤得粗蛋白溶液。
(4)将粗蛋白溶液加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(ph7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥15小时，即得蚯蚓蛋白冻干粉。
(5)将蚯蚓蛋白冻干粉置于300mhz射频中，加入4℃预冷的0.1mol/lph7.8的磷酸缓冲液，过琼脂柱，两端过20000da‐40000da超滤膜，得截留液a和滤过液b。
(6)将截留液a加去离子水脱盐，浓缩至浓缩液呈中性(ph7.0)，浓缩度达到5％时进入真空冷冻干燥机干燥15小时，得到冻干蚓激酶。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。