一种棉花根尖特异性启动子及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，具体而言，涉及一种棉花根尖特异性启动子及其应用。

背景技术：

植物基因的正常表达依赖于基因上游的启动子序列。植物基因工程技术的成功应用需要适合于不同植物背景、不同器官、组织、转基因类型的启动子以避免转基因过程中的不利影响。特异性启动子调控基因只在特定的器官、组织、细胞及不同的发育阶段表达，对于转基因作物的生物安全性以及遗传改造具有重要意义。因此，寻找一些能在细胞、组织、器官以及发育各阶段上更为专一地调控基因表达的启动子，在可控的条件下进行基础研究和作物改良具有重要的意义。

目前，大多数组织特异性启动子的研究主要集中在植物的地上部分，根特异性启动子的研究及应用还很少。然而，根系对植物生长发育的重要性不言而喻，它主要具有吸收水分和营养物质、合成能力、贮藏功能、传导功能、固着和支持作用，此外根系还能够感应来自环境的胁迫因素如干旱、高/低温、盐碱和重金属离子等，并迅速做出反应。根尖是根系生长最活跃的部位，是细胞分裂素、脱落酸、乙烯等植物生长调节物质的主要合成部位，同时是根系感应外部环境因子的主要部位，所以说根尖对根系功能的发挥具有非常重要的作用。根尖部位特异基因的研究，为根尖功能的发挥，进而加强根系功能提供了理论依据，对培育抗干旱、盐碱等逆境因素的作物，提高和改良作物产量和品质具有重要意义。因此，根尖特异性启动子就成为研究根尖基因表达非常必要的基因工程元件，具有广泛的应用价值。

当前，根尖特异性启动子主要源自拟南芥、水稻等模式植物，棉花源的根尖特异性启动子鲜有报道。外源启动子在不同受体中的功能存在差异，已经有很多研究结果证实，但是在相同的种属间作用差别不大。棉花源的根尖特异性启动子的应用，首先在培育抵抗土壤环境胁迫的棉花新品种中具有非常重要的价值，其次对棉属其他作物抗逆品种的选育也具有重要参考或应用价值。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种棉花根尖特异性启动子，所述启动子能够启动外源基因在植物根尖，尤其能够驱动外源基因，在棉属作物的根尖进行特异性地表达，对于棉属作物基因的改良具有重要意义和广泛的应用价值。

本发明的第二～六目的在于提供一种棉花根尖特异性基因表达盒、重组载体、转基因细胞系、转基因重组菌和重组病毒，其包含前述棉花根尖特异性启动子。

本发明的第七目的在于提供前述启动子、基因表达盒、重组载体、细胞系、重组菌或重组病毒在改良棉属作物性状中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种棉花根尖特异性启动子，所述启动子的核苷酸序列如seqidno：1所示。

优选地，在如前所述的棉花根尖特异性启动子中，所述启动子的核苷酸序列与seqidno：1具有至少95％以上的同源性。

优选地，在如前所述的棉花根尖特异性启动子中，所述启动子的核苷酸序列与seqidno：1具有至少96％以上、97％以上、98％以上或99％以上同源性。

本发明还涉及一种棉花根尖特异性基因表达盒，所述基因表达盒由前述启动子、由该启动子启动转录的目的基因和终止子组成。

优选地，在如前所述棉花根尖特异性基因表达盒中，所述目的基因选自抗寒基因、抗旱基因、抗涝基因、抗盐碱基因或抗虫基因。

本发明还涉及一种重组载体，所述载体包括前述启动子或前述基因表达盒。

本发明还涉及一种转基因细胞系，所述转基因细胞系包含前述启动子、基因表达盒或重组载体。

本发明还涉及一种转基因重组菌，所述重组菌包含前述启动子、基因表达盒或重组载体。

优选地，在如前所述的转基因重组菌种，所述重组菌为农杆菌。

本发明还涉及一种重组病毒，所述重组病毒含前述启动子、基因表达盒或重组载体。

本发明还涉及前述启动子、基因表达盒、重组载体、细胞系、重组菌或重组病毒在改良棉属作物性状中的应用。

优选地，在如前所述的改良棉属作物性状的应用中，所述棉属作物选自陆地棉、树棉、草棉或海岛棉。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所述启动子为棉花根尖特异性启动子，所述启动子能够启动外源基因在植物根尖，尤其能够驱动外源基因，在棉属作物的根尖进行特异性地表达。

(2)本发明还涉及含所述启动子的基因表达盒、重组载体、细胞系、重组菌或重组病毒及其在改良作物中的应用，所述应用能够驱动目的基因，例如抗寒基因、抗旱基因或抗病基因等在棉属作物的根尖特异性集中表达，改善根尖的生长特性，从而培养出理想的转基因棉属作物品种，对于棉属作物基因的改良具有重要意义和广泛的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为pcambia2300-35s-gus-camvterm载体示意图；

图2为植物表达载体pca-ghzip40pro限制性内切酶双酶切鉴定电泳图，其中，m：1kbplusdnaladder；1：表达载体酶切后结果；

图3为pca-ghzip40pro转基因拟南芥株系gus染色示意图；其中，a：整株拟南芥图片；b：局部根系图片。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1本发明启动子序列的获得及植物表达载体的构建

1、ghzip40启动子序列的获得

1.1、引物设计

在南京农业大学作物遗传与种质作物创新重点实验室(http://mascotton.njau.edu.cn/html/data/genomefhsequence/2015/05/05/16ab0945-19e9-49f7-a09e-8e956ec866bf.html)下载获得陆地棉异源四倍体标准系tm-1基因组数据，搜寻得到ghzip40基因序列。

根据ghzip40基因编码区的上游序列设计特异性引物，扩增ghzip40基因的长度为1575bp的启动子序列，所述启动子的序列如seqidno：1所示。其中，用于扩增所述启动子的引物序列分别为：

ghzip40pro-f：tgctgtgaacacttgctcctc(seqidno：2)；

ghzip40pro-r：aatggaagattttgttgaaagatgg(seqidno：3)。

1.2、pcr反应

采用ctab法提取陆地棉品种苏棉22的幼嫩叶片的基因组dna。以提取的基因组dna为模板，ghzip40pro-f和ghzip40pro-r为模板，使用mightyampdnapolymerase(takara)进行pcr扩增。

反应程序为：98℃预变性2min后，按以下程序进行pcr扩增，98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸1min30s，共33个循环，最后68℃延伸5min，琼脂糖凝胶电泳，结果显示是1500bp处的条带。

1.3、peasy-t1-ghzip40pro载体的构建

用dna凝胶回收试剂盒按照试剂盒提供的操作步骤回收pcr产物。将pcr产物连接到peasy-t1simple(transgen)克隆载体，将连接产物转化到e.colitrans10(transgen)感受态菌株，在含有卡那霉素抗性的lb培养基上筛选阳性单克隆菌落，经菌落pcr鉴定后送到英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，测序结果正确的菌落在含有卡那霉素的lb液体培养基中培养后用质粒dna小量试剂盒提取质粒。

2、pca-ghzip40pro植物表达载体的构建

2.1、引物设计

重新设计引物，在引物的两端添加kpnⅰ和salⅰ酶切位点，引物序列为：

ghzip40pro-kpnⅰ-f：agaggtacctgctgtgaacacttgctcc(seqidno：4)；

ghzip40pro-salⅰ-r：atagtcgacaatggaagattttgttgaaagat(seqidno：5)。

2.2、pcr反应

用前述质粒peasy-t1-ghzip40pro为模板，ghzip40pro-kpnⅰ-f和ghzip40pro-salⅰ-r为引物，fastpfudnapolymerase(transgen)进行pcr扩增。

pcr反应程序为：95℃预变性2min后，按以下程序进行pcr扩增，95℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸1min，共33个循环，最后72℃延伸5min。

2.3、构建pca-ghzip40pro植物表达载体

将步骤2.1中的pcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，用dna凝胶回收试剂盒按照试剂盒提供的操作步骤回收pcr产物，将pcr产物连接到peasy-blunt(transgen)克隆载体，将连接产物转化到e.colitrans1-t1(transgen)感受态菌株，在含有卡那霉素抗性的lb培养基上筛选阳性单克隆菌落，经菌落pcr鉴定后送到英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，测序结果正确的菌落在含有卡那霉素的lb液体培养基中培养后用质粒dna小量试剂盒提取质粒。

用kpnⅰ和salⅰ双酶切上述提取的质粒，获得ghzip40pro插入片段(酶切后的电泳图谱如说明书附图图2所示)；用kpnⅰ和salⅰ双酶切pcambia2300-35s-gus-camvterm载体(所述载体的图谱如说明书附图图1所示)，切除该载体上的35s片段，获得线性化的植物表达载体。用t4dna连接酶(takara)将插入片段和线性化载体连接，将连接产物转化到e.colitrans1-t1(transgen)感受态菌株，在含有卡那霉素抗性的lb培养基上筛选阳性单克隆菌落，经菌落pcr鉴定后提取质粒，再用kpnⅰ和salⅰ双酶切鉴定所构建的载体，鉴定无误的载体即为pca-ghzip40pro植物表达载体。

实施例2转基因拟南芥植株的获得及gus染色鉴定

1、转化pca-ghzip40pro拟南芥植株的获得

采用农杆菌介导的蘸花法将pca-ghzip40pro植物表达载体转入拟南芥，将收获的种子在含有kan(使用浓度25μg/ml)的1/2ms培养基上进行筛选，获得具有kan抗性的植株，用pcr(引物为ghzip40pro-f和ghzip40pro-r)进行进一步的鉴定确认，获得t0代转基因拟南芥。

2、转基因拟南芥gus组织化学染色鉴定

以野生型拟南芥为对照，对转化有ghzip40启动子驱动的gus转基因拟南芥进行组织化学染色分析。收集新鲜的转基因拟南芥植物样品(整株幼苗，叶片，花和根等)放入含有1ml90％丙酮的1.5ml离心管中；样品收集完后，在室温放置20～30min；丙酮处理之后用预冷的染色缓冲液清洗植物样品；将样品浸泡在含有0.2mmx-gluc的染色液中，然后37℃染色2h以上；用移液器吸净染色液，室温条件下，依次在20％，35％，50％的酒精中分别浸泡30min进行脱色处理；然后在室温条件下，植物样品在faa固定液中浸泡30min以上；直接在显微镜下进行组织水平观察。faa固定液含有50％乙醇、10％冰醋酸和5％甲醛。gus染色缓冲液含有50mm磷酸钠缓冲液(ph7.2)、0.2％tritonx-100、2mm亚铁氰化钾和2mm铁氰化钾。

染色结果表明，整株幼苗只在根尖部位有表达，而其他组织部位未见表达(具体染色结果参见说明书附图图3)。由此说明，ghzip40基因启动子可以驱动基因在植物根尖特异性表达的特性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

sequencelisting

<110>江苏省农业科学院

<120>一种棉花根尖特异性启动子及其应用

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1575

<212>dna

<213>gossypiumhirsutum

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<213>人工序列

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