本发明属于植物病害生物防治技术领域，更具体涉及一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌hnt7，同时还涉及一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌hnt7的制备方法，再涉及一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌hnt7的用途。
背景技术：
梨树锈病由担子菌门胶锈菌属梨胶锈菌(gynmosporangiumharaeanumsyd.＝gynmosporangiumasiaticummiyabeexyamada)引起，在中国梨园内发生较为普遍，可以导致叶片和果实脱落，严重影响产量。目前中国主要采用化学药剂进行防治，如代森锰锌、烯唑醇、三唑酮等，生物防治除了有报道采用梨胶锈菌重寄生菌(葡酒锈生座孢tuberculinavinosasacc.)进行防治外，尚无商品化的生防制剂。长期施用化学农药可以导致农残超标，并易使病原菌产生抗药性，导致防治效果下降。此外，长期、反复和大量使用化学农药可引起土壤、水体和大气的污染，同时也杀伤了其他有益微生物，破坏了生态平衡。从植物内筛选利用有益微生物，抑制病原菌的生长进行防病具有显著的经济和生态效益。
目前，抗病微生物以芽孢杆菌为主，已经发现具有防病潜力的芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(b.cereus)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、短小芽孢杆菌(b.pumilis)、多粘芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)、侧胞芽孢杆菌(b.laterosporus)、短小芽孢杆菌(b.pumilus)等，但这些芽孢杆菌主要用于防治由曲霉、镰孢菌、链格孢、轮枝孢和腐霉菌引起的作物根部的病害如立枯病、猝倒病、枯萎病、根腐病、茎腐病、立枯病【kabalukt,gazdikk:directoryofmicrobialpesticidesforagriculturalcropsinoecdcountries.agricultureandagri-food.http://www4.agr.gc.ca/resources/prod/doc/pmc/pdf/micro_e.pdf2005,accessednovember2014】，没有涉及梨树锈病的防治。
贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)相关研究较少，前期报道该菌对棉花黄萎病菌(verticilliumdahliaekleb)、白菜黑斑病病菌(alternariabrassicae)和番茄灰霉病灰菌(botrytiscinereapers)和兰花枯萎病菌(fusariumoxysporiumschlecht.)具有拮抗作用【王伟,李术娜,李红亚,等.大丽轮枝菌拮抗细菌菌株12-51的筛选鉴定与抗菌物性质分析[j].中国农学通报,2009,25(19):14-19.杜淑涛,李术娜,朱宝成.白菜黑斑病拮抗细菌bacillusvelezensisdl-59的筛选鉴定及田间防效实验[j].河北农业大学学报,2010,33(6):51-56.王伟,李术娜,李红亚,等.番茄灰霉病拮抗细菌的筛选与x-75菌株鉴定[j].园艺学报,2010,37(2):307-312.索雅丽,李术娜,李红亚,等.番茄灰霉病菌颉颃菌株的筛选及功能基因的分析[j].中国植保导刊,2010,8:7-10.连彩,郭晓军,朱宝成,等.兰花枯萎病拮抗细菌的筛选与鉴定[j].华北农学报,2012,27(2):222-225】，韩国学者发现该菌s3-5菌株对稻瘟病菌等有强拮抗作用【choegyeongjak,jinc,etal.bacillusvelezensiss3-5strainandmethodforthebiological[p].republicofkorea,2008,10-1089149】，欧洲有研究者已将该菌ah2菌株申请专利作为作物病害的生物制剂[fernandezmai,villaverdefmj,casanovarja,etal.apurecultureofstrainah2ofthebacillusvelezensisspeciesandaproductforthebiologicalcontrolofphytopathogenicfungi[p].europe,2008,(pat-ep2138044a1.]。目前，国内外尚无研究采用该菌进行梨树锈病的防治。
技术实现要素：
本发明的目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌hnt7，革兰氏染色反应阳性，芽孢杆状，单生或两个串生，大小为0.8-(1.1)-1.3×2.3-(3.0)-4.2μm。该菌株具有广谱抗真菌活性，如对果生核盘菌(moniliniafructicola)、拟盘多毛孢菌(pestalotiopsistheae)、葡萄座腔菌(botryosphaeriaberengeriana)、链格孢菌(alternariaalternata)、胴枯病菌(phomopsisfukushii)等均具有显著的抑菌活性，贝莱斯芽孢杆菌hnt7具有较强的活性以及耐储存特性，对梨锈病具有良好的防治效果、环境友好、抗菌谱广和防止梨树早期落叶的效果。
本发明还有一个目的是在于提供了一种具有广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌hnt7的制备方法，方法易行，操作简便，制备的液体发酵液易溶于水，方便使用。
本发明还有一个目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌hnt7在制备治疗或预防梨树锈病药物中的应用，该菌株的发酵液对梨锈病具有显著的防病效果，防效达到70.76％以上，优于较常用的化学杀菌剂甲基硫菌灵的防效(59.49％-63.7％)。此外，经过贝莱斯芽孢杆菌hnt7喷施的梨树，可以显著抑制梨树提前落叶，有利于增强树势。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌hnt7的制备方法，其步骤是：
a、无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌hnt7菌株单菌落，接种于装有25mllb培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl10g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min)的100ml三角瓶中，放置在恒温培养振荡器nsky－200b中，调节温度为26－30℃、转速为150r/min，振荡培养22－26h。
b、需要准备500ml三角瓶10个，每瓶装200ml发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，26－30℃下150r/min振荡培养46－50h。
c、拮抗菌的分离：在湖北省武汉市华中农业大学茶园采集健康的台茶四号茶叶，先用浓度为75％的酒精浸泡28－32s，再用无菌水漂洗2－4次，用无菌解剖刀将其切成长度约1cm的正方形小块，放于pda培养基(200g马铃薯、20g蔗糖、15g琼脂粉溶于1000ml蒸馏水，ph值7.0左右)上，于25℃培养箱中暗培养2－4d左右，将长出来的细菌菌落转移至新的pda培养基上划线分离纯化单菌落。
d、分离纯化后，获得一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7，菌株编号为hnt7，平板对峙实验中对多种致病菌(见下)具有很强的拮抗能力，田间对梨树锈病具有良好防效。对该菌提取dna后，分别采用pcr技术扩增其16srdna、gyrb和rpob部分基因，提交生物公司进行序列测定，获得了所述的核苷酸序列，序列为seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3，序列比对显示其与登录的贝莱斯芽孢杆菌相似性最高。该菌株分类命名为贝莱斯芽孢杆菌hnt7，保存于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccm2018022。通过上述措施获得一株健康茶叶片上的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7。
一株健康茶叶片上的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7，其于2017年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccm2018022。
菌株hnt7经过发酵后可以应用于梨树锈病的防治，并可以阻止因锈病危害造成的梨树叶片脱落。
拮抗菌的分子鉴定:
对拮抗细菌基因组dna的提取，以提取的dna为模版，采用bsf(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)和bsr(5′-aaggaggtgatccagccgca-3′)引物对16srdna部分序列进行扩增，预期大小为1500bp。pcr反应条件为95℃预变性4min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃再延伸5min，16℃终止。
采用同源引物(5’gaagtcatcatgaccgttctgcaygcnggnggnaarttyga3’)和互补引物(5’agcagggtacggatgtgcgagccrtcnacrtcngcrtcngtcat)对gyrb部分序列进行扩增，预期大小约为1180bp。pcr反应条件为pcr反应程序：94℃2min，94℃1min，66℃1min，72℃2min，30个循环，72℃延伸7min，16℃保存。
采用同源引物(5’aggtcaactagttcagtatggac3’)和互补引物(5’aagaaccgtaaccggcaactt3’)对rpob基因部分序列进行扩增，预期大小约为560bp。pcr反应程序：94℃2min，94℃30s，51℃45s，68℃50s，40个循环，68℃90s，16℃保存。
pcr产物都经浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳分析，将目标片段纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将获得序列与ncbi数据库中序列采用blastn进行相似性分析，结果表明菌株hnt7的16srdna序列(seqidno：1所示的核苷酸序列)与bacillusvelezensisnkg-1的16srdna序列(序列登陆号：cp024203.1)同源率为99％(coverage98％,evalue0.0,identity99％)；gyrb序列(seqidno：2所示的核苷酸序列)与bacillusvelezensisj01的gyrb序列(序列登陆号：cp023133.1)同源率为99％(coverage98％,evalue0.0,identity99％)；rpob序列(为seqidno：3所示的核苷酸序列)与bacillusvelezensiss141的rpob序列(序列登陆号：ap018402.1)同源率为99％(coverage96％,evalue0.0,identity99％)；
拮抗菌的菌落和形态特征
革兰氏染色反应阳性，芽孢杆状，单生或两个串生，大小为0.8-(1.1)-1.3×2.3-(3.0)-4.2μm(图1)。在lb平板上，贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7菌株的菌落呈圆形，淡黄色，有褶皱，不透明，菌落边缘常不整齐(图2)。
拮抗菌的液体发酵培养：
无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌hnt7菌株单菌落，接种于装有25mllb培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl10g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min)的100ml三角瓶中，放置在恒温培养振荡器nsky－200b中，调节温度为28℃、转速为150r/min，振荡培养24h。每瓶装200ml发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，28℃下150r/min振荡培养48h。
一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌hnt7在作为保护梨树或预防梨树锈病的药物中的应用，其步骤是：
a、施药时期：在每年的3-4月份，采用手动喷雾器或机动喷雾器，在晴天早晨9时前和下午4时后或多云天气(主要为了避开高温时间)，进行喷雾施药，均匀喷施叶片表面。每隔10天再喷施1次，连续喷施3次。若喷施后24h遇到大雨天气，天晴后应再补施一次。
b、用量：取贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株hnt7发酵液，每亩地500ml，按照100-500倍浓度用水稀释。
c、叶片喷雾时候，可以与叶面肥和生长调剂剂一起使用。但不能与铜制剂或杀细菌剂混合使用。
拮抗菌的拮抗实验:
采用平板对峙法筛评价菌株贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7对真菌的拮抗活性：在pda培养基上，用接种环取10μl摇培的菌液涂划于培养皿的一端，在离细菌线的6cm处接直径为5mm的菌丝块，设置无抑制菌处理为对照，每个处理重复3培养皿，于25℃暗培养，当对照组刚长满整培养皿时，测量各处理抑菌圈大小，根据有无抑菌带及抑菌带的大小判断其拮抗效果。
测试拮抗菌株包括果生核盘菌(moniliniafructicola)、拟盘多毛孢菌(pestalotiopsistheae)、葡萄座腔菌(botryosphaeriaberengeriana)、链格孢菌(alternariaalternata)、胴枯病菌(phomopsisfukushii)，由本实验室前期分离所得。结果显示，贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7对致病真菌均有强的抑菌作用，抑菌范围为12-30mm，且对不同的致病菌的抑菌效果具有显著性差异(图3)。
拮抗菌的田间防病实验：
2017年3月至4月在华中农业大学南湖梨园进行大田药效试验。实验药剂：7％甲基硫菌灵、贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7发酵液、清水对照。
实验共设3个处理，每个品种的每个处理设置4个重复，每个重复3棵树。共计12个小区，36棵树。小区间设保护行。采用喷雾法处理，在晴天早晨9时前和下午4时后进行，避开高温时间。每隔10d喷一次，连喷3次。
调查方法：每小区采用五点取样法，每点自上至下调查30片叶子，调查发病情况，以片为单位记录各级病指数。
分级标准：
0级：没有发病
1级：每片叶有1～2个病斑；
2级：每片叶有3～4个病斑；
3级：每片叶有5～6个病斑；
4级：每片叶有7个及以上病斑。
结果显示，贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7发酵液具有显著的防病效果(图4)，在两个品种(黄花和丰水梨)的梨树上对梨锈病均表现良好的防病效果，防病达到62.03％和70.76％，优于化学农药甲基硫菌灵的防效(59.49％和63.7％)(表1)。秋季(9月中旬)观察落叶情况，喷施贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7发酵液的梨树叶片仍保持绿色，较少落叶，而清水对照叶片已经大量脱落(图4)
表1采用贝莱斯芽孢杆菌hnt7发酵液和甲基硫菌灵防治梨锈病后的病情指数和防治效果
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
a、目前，抗病微生物以芽孢杆菌为主，已经发现具有防病潜力的芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(b.cereus)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、短小芽孢杆菌(b.pumilis)、多粘芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)、侧胞芽孢杆菌(b.laterosporus)、短小芽孢杆菌(b.pumilus)等，没有涉及梨树锈病的防治。
b、贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)相关研究较少，前期报道该菌对棉花黄萎病菌(verticilliumdahliaekleb)、白菜黑斑病病菌(alternariabrassicae)和番茄灰霉病灰菌(botrytiscinereapers)和兰花枯萎病菌(fusariumoxysporiumschlecht.)具有拮抗作用，韩国学者发现该菌s3-5菌株对稻瘟病菌等有强拮抗作用。目前，尚无研究采用该菌进行梨树锈病的防治。
c、目前，其它芽孢杆菌是否可以用于梨锈病的防治尚缺乏室内和室外的药效试验数据，贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7是首次发现的对梨锈病具有良好防效的芽孢杆菌。
d、目前，其它芽孢杆菌是否对梨树早期落叶具有一定的防效尚缺乏室内和室外的药效试验数据，贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7是首次发现的对梨树早期落叶具有良好防效的芽孢杆菌。在黄花梨上对锈病防效为62.03％，在丰水梨上防效为70.76％，均优于对照化学农药甲基硫菌灵的防效(分别为59.49％和63.70％)。
附图说明
图1为一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7透射电镜下观察到的细胞形态及革兰氏染色后在油镜先观察到的形态示意图。
hnt7透射电镜下观察显示呈杆状，有粘质层(a)；革兰氏染色后hnt7菌细胞呈紫色(b)，个别细胞中有芽孢，显示为革兰氏阳性。
图2为一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7形态及抑制病原真菌的作用效果示意图。
pda培养基下方为果生核盘菌(moniliniafructicola)菌株，显示生长被周围菌株抑制；pda培养基上方为(bacillusvelezensis)hnt7划线生长菌落。
图3为一种在pda培养基上贝莱斯芽孢杆菌hnt7对6个真菌菌株的对峙抑菌效果分析示意图。
平板一端为划线的贝莱斯芽孢杆菌hnt7，距其6cm处的另一端为接种的真菌菌丝块。设置不加菌株hnt7，仅接种真菌菌丝块的平板为空白对照。所用真菌和菌株标注在平板上方。
yz：果生核盘菌(moniliniafructicola)yc-2-1：拟盘多毛孢菌(pestalotiopsistheae)
tcf3-4：链格孢菌(alternariaalternata)mao+：葡萄座腔菌(botryosphaeriaberengeriana)
5-1：枝枯病菌(phomopsisfukushii)3-1：链格孢菌(alternariaalternata)
图4为一种hnt7田间防治梨锈病代表效果图。
左上：喷施清水对照秋季梨树叶片提前大量脱落；中上：喷施贝莱斯芽孢杆菌hnt7三次后梨树叶片仍保持绿色，很少脱落；右上：喷施甲基硫菌灵后梨树叶片部分脱落；左下：喷施清水对照梨树叶片；中下：喷施贝莱斯芽孢杆菌hnt7三次后梨树叶片；右下：喷施甲基硫菌灵后梨树叶片。
具体实施方式
实施例1：
无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌hnt7菌株单菌落，接种于装有25mllb培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl10g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min)的100ml三角瓶中，放置在恒温培养振荡器nsky－200b中，调节温度为26-30℃、转速为150r/min，振荡培养24h。每瓶装200ml发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，26-30℃下150r/min振荡培养48h。
一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌dyr3.3的制备方法，其步骤是：
a、无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌hnt7菌株单菌落，接种于装有25mllb培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl10g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min)的100ml三角瓶中，放置在恒温培养振荡器nsky－200b中，调节温度为26或28或30℃、转速为150r/min，振荡培养24h。
b、需要准备500ml三角瓶10个，每瓶装200ml发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，26或28或30℃下150r/min振荡培养46h。
c、在湖北省武汉市华中农业大学茶园采集健康的台茶四号茶叶，先用浓度为75％体积比的酒精浸泡30s，再用无菌水漂洗3次，用无菌解剖刀将其切成长度约1cm的正方形小块，放于pda培养基(200g马铃薯、20g蔗糖、15g琼脂粉溶于1000ml蒸馏水，ph值7.0左右)上，于24或25℃培养箱中暗培养2或3d左右，将长出来的细菌菌落转移至新的pda培养基上划线分离纯化单菌落。
d分离纯化后，获得一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7，菌株编号为hnt7，平板对峙实验中对多种致病菌(见下)具有很强的拮抗能力，田间对梨树锈病具有良好防效。该菌株分类命名为贝莱斯芽孢杆菌hnt7，保存于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccm2018022。
通过上述措施获得一株健康茶叶片上的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7。
一株健康茶叶片上的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7，其于2017年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccm2018022。
实施例2：
一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)在制备治疗或预防梨果实腐烂病药物中的应用，其步骤是：
a、施药时期：在每年的3或4月份，采用手动喷雾器或机动喷雾器，在晴天早晨9时前和下午4时后或多云天气(主要为了避开高温时间)，进行喷雾施药，均匀喷施叶片表面。每隔10天再喷施1次，连续喷施3次。若喷施后24h遇到大雨天气，天晴后应再补施一次。
b、用量：取贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)菌株hnt7发酵液，按照100-500倍浓度用水稀释，每亩地500ml。
c、叶片喷雾时候，不能与铜制剂或杀细菌剂混合使用。
拮抗菌的拮抗实验
采用平板对峙法筛评价菌株贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7对真菌的拮抗活性：在pda培养基上，用接种环取10μl摇培的菌液涂划于培养皿的一端，在离细菌线的6cm处接直径为5mm的菌丝块，设置无抑制菌处理为对照，每个处理重复3培养皿，于25℃暗培养，当对照组刚长满整培养皿时，测量各处理抑菌圈大小，根据有无抑菌带及抑菌带的大小判断其拮抗效果。
测试拮抗菌株包括果生核盘菌(moniliniafructicola)、拟盘多毛孢菌(pestalotiopsistheae)、葡萄座腔菌(botryosphaeriaberengeriana)、链格孢菌(alternariaalternata)、胴枯病菌(phomopsisfukushii)，由本实验室前期分离所得。结果显示，贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7对致病真菌均有强的抑菌作用，抑菌范围为12-30mm，且对不同的致病菌的抑菌效果具有显著性差异(图3)。
拮抗菌的发酵
无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌hnt7菌株单菌落，接种于装有25mllb培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl10g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min)的100ml三角瓶中，放置在恒温培养振荡器nsky－200b中，调节温度为26-30℃、转速为150r/min，振荡培养24h。每瓶装200ml发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，26-30℃下150r/min振荡培养48h。
拮抗菌的田间防病实验
2017年3月至4月在华中农业大学南湖梨园进行大田药效试验。实验药剂：7％甲基硫菌灵、贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7发酵液、清水对照。
实验共设3个处理，每个品种的每个处理设置4个重复，每个重复3棵树。共计12个小区，36棵树。小区间设保护行。采用喷雾法处理，在晴天早晨9时前和下午4时后进行，避开高温时间。每隔10d喷一次，连喷3次。
调查方法：每小区采用五点取样法，每点自上至下调查30片叶子，调查发病情况，以片为单位记录各级病指数。
分级标准：
0级：没有发病
1级：每片叶有1～2个病斑；
2级：每片叶有3～4个病斑；
3级：每片叶有5～6个病斑；
4级：每片叶有7个及以上病斑。
结果显示，贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7发酵液具有显著的防病效果(图4)，在两个品种(黄花和丰水梨)的梨树上对梨锈病均表现良好的防病效果，防病达到62.03％和70.76％，优于化学农药甲基硫菌灵的防效(59.49％和63.7％)(表1)。秋季(9月中旬)观察落叶情况，喷施贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)hnt7发酵液的梨树叶片仍保持绿色，较少落叶，而清水对照叶片已经大量脱落(图4)。
序列表
<110>华中农业大学
<120>一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌hnt7及制备方法和应用
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1468
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ggggacctttggcggcgttgctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctc60
cctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggat120
aactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataa180
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ctgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacga360
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