本发明属于猪的分子标记筛选技术领域，具体涉及kpna7基因作为猪繁殖性状相关的分子标记及应用，所述的猪繁殖性状包括猪产活仔数(nba)、有效活仔数(enba)、仔猪初生重均匀度(cv)、木乃伊个数(mummy)等性状。所述的分子标记从猪kpna7基因中克隆得到，它包括猪kpna7基因第6外显子序列中突变位点的检测及其应用。
背景技术：
在养猪业中，产活仔数、有效活仔数等是重要的经济性状，这些性状属于低遗传力性状(schneideretal2012)，利用传统育种手段对这些繁殖性状进行改良耗时长、进程缓慢。在现代育种工作中，分子育种成为有效改良繁殖性状的新途径，因此猪繁殖性状相关调控基因或标记的鉴定能够为运用分子育种技术改良猪繁殖性状奠定基础。
国内外研究者发现，中国太湖流域猪种的高产仔性能与其高排卵能力相关，排卵数是决定产仔数的第一要素(张照1991；terguietal1992)。后又有研究发现黄体数与天津白猪、长白猪的妊娠30天胚胎数、产仔数之间成正相关(周双海等2001)。foxcroft等(2006)认为排卵数多除了可以提高产仔数，可能还会因为子宫容受性紧张带来负面结果，如降低胎儿成活率、影响胎儿体重和胴体品质等。因此，猪卵母细胞的发育、成熟可能影响排卵数，从而影响产仔数等有关繁殖性状。
guo等(2016)利用全基因组关联分析手段发现kpna7基因的第6内含子和第8内含子位于与猪产仔数、5天活仔数性状相关的qtl区域内。kpna7基因属于核转运蛋白家族(kayopherin)，主要介导大分子物质在细胞核内外的转运，参与基因表达、细胞分裂、细胞凋亡、细胞极性建立等重要生物学过程(樊静和朱运松2003)。研究发现kpna7在牛卵母细胞中表达，敲除kpna7基因，导致早期胚胎发育异常(tejomurtulaetal2009)。在小鼠中，kpna7基因在小鼠卵母细胞中表达，突变该基因后，发现在妊娠8.5天后部分胚胎死亡，小鼠繁殖力降低(huetal2010)。近来有研究发现kpna7基因在猪的gv、mⅱ卵母细胞、2-cell胚胎和4-cell胚胎中表达，可能调控猪卵母细胞成熟和胚胎早期分裂(xinwangetal2012)。鉴于以上研究结果，申请人认为kpna7基因可能在猪卵母细胞发育、成熟及早期胚胎发育过程中发挥重要作用，从而影响母猪的繁殖性状。对基因突变的多态性位点在群体中进行关联分析是研究基因功能的一个有力方法，所以申请人对kpna7基因进行了多态性关联分析，以期为猪的繁殖性状提供新的分子标记。
技术实现要素：
发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用kpna7基因片段作为猪繁殖性状相关的分子标记及应用。本发明涉及的猪的繁殖性状主要包括产活仔数(nba)、有效活仔数(enba)、仔猪初生重均匀度(cv)和木乃伊个数(mummy)等性状。本发明的分子标记从kpna7基因第6外显子中克隆得到，通过建立突变位点的多态性检测方法，为母猪产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数等性状检测提供关联标记。
本发明的技术方案如下：
申请人筛选得到一种与猪繁殖性状尤其是与产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数性状相关的分子标记，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示：
ttgttgcctagctcggtgagctcatttaaagacactcactggtacay(c/t)ttgaggaagccagggccagcagatgtgggatggcattgctggagataacgatgtctctgaattctgcgccatcacctacaaataggggagaacatgacactcaaagagggaacacagggaacccggggtgggtgacgaattctt，
上述序列中47位的y是c或t，该突变导致hpy166ii-rflp多态性。
申请人设计了一种检测上述分子标记的引物对，该分子标记的引物对的dna序列如下所示：
正向引物：ttgttgcctagctcggtgag，
反向引物：aagaattcgtcacccacccc。
申请人提供了一种与猪繁殖性状尤其是与产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数性状相关的分子标记(即kpna7基因外显子6)的筛选方法和pcr-hpy166ii-rflp在猪产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度、木乃伊个数性状中的关联分析应用方法，所述方法的具体步骤如下所述：
(1)通过在ensemble(见：http://www.ensembl.org/sus_scrofa/gene/summary)数据库中查阅，申请人在kpna7基因的第6外显子中找到一个候选的snp(编号为rs326578619,sscrofa10.2)；
(2)根据ncbi数据库(sscrofa10.2)中猪kpna7基因的基因组序列(genebankaccession:nc_010445.4)设计引物对突变位点进行克隆，其中正向引物为：5’-
ttgttgcctagctcggtgag-3’，反向引物为：5’-aagaattcgtcacccacccc-3’(seqidno:2和seqidno:3)，然后从大白猪母猪耳组织样品中提取基因组dna作为模板，克隆得到kpna7基因部分dna序列，序列如下所示(长度为191bp，序列表seqidno：1的序列如下，但第47位的序列是突变后即替换的序列)：
ttgttgcctagctcggtgagctcatttaaagacactcactggtacayttgaggaagccagggccagcagatgtgggatggcattgctggagataacgatgtctctgaattctgcgccatcacctacaaataggggagaacatgacactcaaagagggaacacagggaacccggggtgggtgacgaattctt，
上述序列中的y是t或c，该突变导致hpy166ii-rflp多态性；
其中：上述序列中第1-20序列是扩增该片段的正向引物，第172-191位序列是扩增该片段的反向引物序列(上述引物序列同时也是检测本发明筛选的分子标记多态性的引物序列)；
(3)应用pcr-rflp方法对上述序列的第47位碱基进行检测：
其中，snp检测方法为：在扩增得到的191bp片段上，存在一个hpy166ii酶切位点，pcr产物经酶切后电泳检测，测序检测结果显示在kpna7基因的该c/t位点存在3种基因型(如图3所示)：即：cc(44bp、147bp)基因型，ct基因型(191bp、147bp、44bp)，tt基因型(191bp)。酶切电泳结果证实kpna7基因第6外显子内该突变位点存在。
(4)该突变位点(rs326578619)在母猪繁殖性状中的应用尚不明确，因此，本发明将位点基因型与母猪繁殖性状进行关联分析。
本发明的分子标记可在猪繁殖性状尤其是产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数性状标记辅助选择中应用。
本发明的引物对可在猪繁殖性状尤其是产活仔数、有效活仔数、仔猪初生重均匀度和木乃伊个数性状标记辅助选择中应用。
更详细的技术方案和效果如《具体实施方式》所示。
附图说明
序列表seqidno:1是本发明筛选的分子标记的核苷酸序列，序列长度为191bp，在该序列的第47bp处存在一个等位基因的图案(c或t突变)，该突变导致hpy166ii-rflp多态性。
序列表seqidno:2是检测分子标记(也是扩增kpna7基因片段的正向引物序列)的正向引物序列。
序列表seqidno3是检测分子标记(也是扩增kpna7基因片段的反向引物序列)的反向引物序列。
图1：本发明技术流程图。
图2：本发明筛选的分子标记的核苷酸序列(下划线部分序列为引物序列，其中英文字母y代表突变位点，该位点位于第47碱基处)。
图3：本发明中kpna7基因hpy166ii-rflp存在三种基因型(即：cccttt)电泳结果。附图标记说明：图3中m：dna分子量标准(dl2000，购自宝生物工程大连有限公司)。泳道1：pcr产物，泳道2：cc型，泳道3：ct型，泳道4：tt型
具体实施方式
实施例1pcr-rflp诊断方法的建立
(1)引物序列：
正向引物：5’ttgttgcctagctcggtgag3’，
反向引物：5’aagaattcgtcacccacccc3’；
pcr扩增条件：
pcr反应总体积为10μl，其中猪基因组dna约100ng，5μlpcrmix，上述正向引物、反向引物各0.2μl。pcr扩增程序为：94℃5min，循环32次94℃30s，60℃30s，然后72℃25s，最后72℃延伸5min。pcr反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到191bp(seqidno:3)特异扩增片段。
(2)pcr-rflp检测条件
pcr产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer1μl，pcr产物3μl，限制性内切酶hpy166ii为0.5μl(1u)，用h2o补足至10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴1h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第47bp位置是t时，则该hpy166ii酶切位点不存在，hpy166ii酶切后检测结果只有1个片段，长度是191bp(定为等位基因t)。但存在t47→c47替换时，其结果导致第47bp处一个hpy166ii酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为44bp和147bp(定为等位基因c)，三种基因型cc、ct、tt如图3所示。
实施例2本发明的分子标记在猪产活仔数标记性状关联分析中的应用
本实施例关联分析所用的实验猪群来自南方某猪场的大白猪，为丹系大白猪母猪530头，并对全部母猪进行基因型检测，确定其基因型。丹系大白猪产活仔数(nba)性状取自猪场2016-2017年的繁殖记录资料。
根据采集样本的繁殖记录信息和群体结构，本发明运用一般线性模型来统计分析kpna7基因snp位点的基因型效应及其与产活仔数性状的关系。
采用sas软件对该突变位点的多态性进行性状关联分析，具体模型如下：
yilm＝μ+genei++mate_seasonl+number_of_littermatem+eilm
y为性状值，μ为总体均数，固定效应：基因型效应genei、配种季节mate_seasonl；协变量：母猪同窝仔猪数number_of_littermatem；eilm为随机误差。
对丹系大白猪kpna7基因hpy166ii-rflp多态性位点进行性状关联分析，该突变位点分型的结果为：丹系大白猪cc型207头、ct型151头、tt型172头。将丹系大白母猪产活仔数性状与基因型作关联分析，发现此突变与丹系大白猪头胎产活仔数显著关联(p<0.05)，ct型个体和tt型个体产活仔数显著高于cc型个体(p<0.05)，ct型母猪产活仔数和tt型母猪产活仔数没有显著差异。结果见表1。
表1猪kpna7基因snp位点与丹系大白猪头胎产活仔数的关联分析结果
注：表1中性状值为最小二乘均数±标准误，p<0.05代表有显著性差异。
实施例3本发明的分子标记在猪有效产活仔数标记性状关联分析中的应用
本实施例关联分析所用的实验猪群来自中国南方某猪场的大白猪，美系大白母猪有262头，并对全部母猪进行了基因型检测，以确定其基因型。经产(三胎及以上)美系大白猪有效产活仔数(enba)性状取自猪场2016-2017年的繁殖记录资料。
根据采集样本的繁殖记录信息和群体结构，本发明运用一般线性模型来统计分析kpna7基因snp位点的基因型效应及其与有效产活仔数性状的关系。
采用sas软件对该突变位点的多态性进行性状分析，具体模型如下：
yijlm＝μ+genei+parityj+mate_seasonl+number_of_littermatem+eijlm
y为性状值，μ为总体均数，其中固定效应包括：基因型效应genei、胎次效应prityj、配种季节mate_seasonl；协变量：母猪同窝仔猪数number_of_littermatem；eijlm为随机误差。
对大白猪kpna7基因hpy166ii-rflp多态性位点进行性状关联分析，美系大白猪中cc型34头、ct型90头、tt型138头。将母猪有效产活仔数性状与基因型作关联分析发现此突变与经产美系大白猪有效产活仔数显著关联(p<0.05)，ct型个体和tt型个体有效产活仔数显著多于cc型个体(p<0.05)，ct型个体和tt型个体有效产活仔数没有显著差异。结果见表2。
表2猪kpna7基因snp位点与经产美系大白猪有效产活仔数性状关联分析结果
注：表2中性状值为最小二乘均数±标准误，p<0.05代表有显著性差异。
实施例4本发明的分子标记在仔猪初生重均匀度标记性状关联分析中的应用
本实施例关联分析所用的实验猪群来自中国南方某猪场的大白猪，丹系大白母猪530头，并对全部母猪进行基因型检测，确定其基因型。仔猪初生重均匀度(cv)性状取自猪场2016-2017年的繁殖记录资料。
根据采集样本的繁殖记录信息和群体结构，本发明运用一般线性模型来统计分析kpna7基因snp位点的基因型效应及其与仔猪初生重均匀度的关系。
采用sas软件对该突变位点的多态性进行性状关联分析，具体模型如下：
yilm＝μ+genei+mate_seasonl+number_of_littermatem+eilm
y为性状值，μ为总体均数，其中固定效应包括：基因型效应genei、配种季节mate_seasonl；协变量母猪同窝仔猪数：number_of_littermatem；eilm为随机误差。
对大白猪kpna7基因hpy166ii-rflp多态性位点进行性状关联分析，该突变位点基因型分型结果为：丹系大白猪cc型，207头、ct型，151头、tt型，172头。将仔猪初生重均匀度与基因型作关联分析，发现该突变与丹系大白猪母猪第二胎仔猪初生重均匀度极显著关联(p<0.01)，其中cc型个体仔猪初生重均匀度显著优于ct型个体(p<0.05)，cc型个体仔猪初生重均匀度极显著优于tt型个体(p<0.01)。结果见表3。
表3猪kpna7基因snp位点与丹系大白母猪第二胎仔猪初生重均匀度的关联分析结果
注：表3中性状值为最小二乘数±标准误，p<0.05代表有显著性差异，p<0.01代表有极显著差异。
实施例5本发明的分子标记在母猪木乃伊数目标记性状关联分析中的应用
本实施例关联分析所用的实验猪群来自中国南方某猪场的大白猪，所用丹系大白母猪530头，并对全部大白猪的母猪进行基因型检测，确定其基因型。木乃伊数目性状取自猪场2016-2017年的繁殖记录资料，记录经产母猪产木乃伊数目(mummy)。
根据采集样本的繁殖记录信息和群体结构，本发明运用一般线性模型来统计分析kpna7基因snp位点的基因型效应及其与木乃伊性状的关系。
采用sas软件对该突变位点的多态性进行性状分析，具体模型如下：
yijlm＝μ+genei+parityj+mate_seasonl+number_of_littermatem+eijlm
y为性状值，μ为总体均数，其中固定效应包括：基因型效应genei、胎次效应parityj、配种季节mate_seasonl；协变量：母猪同窝仔猪数number_of_littermatem；eijlm为随机误差。
对大白猪kpna7基因hpy166ii-rflp多态性位点进行性状关联分析，结果见表4。
表4猪kpna7基因snp位点与经产丹系大白猪产木乃伊个数关联分析结果
注：表4中性状值为最小二乘均数±标准误，p<0.05代表有显著性差异，p<0.01代表有极显著差异。
该突变位点分型结果为：丹系大白猪cc型，207头、ct型，151头和tt型，172头。将仔猪初生重均匀度与基因型作关联分析，发现该突变与经产丹系大白猪产木乃伊性状显著关联(p<0.05)，其中cc型个体产木乃伊个数显著多于ct型个体(p<0.05)，cc型个体产木乃伊个数极显著多于tt型个体(p<0.01)。
序列表
<110>华中农业大学
<120>kpna7基因片段作为猪繁殖性状相关的分子标记及应用
<141>2018-06-25
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>191
<212>dna
<213>猪(susscrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(191)
<220>
<221>mutation
<222>(47)..(47)
<400>1
ttgttgcctagctcggtgagctcatttaaagacactcactggtacatttgaggaagccag60
ggccagcagatgtgggatggcattgctggagataacgatgtctctgaattctgcgccatc120
acctacaaataggggagaacatgacactcaaagagggaacacagggaacccggggtgggt180
gacgaattctt191
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>猪(susscrofa)
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(20)
<400>2
ttgttgcctagctcggtgag20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>猪(susscrofa)
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(20)
<400>3
aagaattcgtcacccacccc20