一种快速检测抗血栓个体化用药基因多态性的试剂盒及方法与流程

本发明涉及一种检测基因多态性的试剂盒及方法，特别是涉及一种快速检测抗血栓个体化用药基因多态性的试剂盒及方法，属于基因检测技术领域。

背景技术：

细胞色素cyp450酶系是药物在体内的主要代谢酶系，cyp2c19基因编码的s-美芬妥英羟化酶是其重要成员，其遗传多态性影响着氯吡格雷、奥美拉唑、苯妥英钠和地西泮等许多药物的代谢。

人类cyp2c19基因定位于10q24.1-24.3，目前，发现cyp2c19存在至少25种等位基因，其中*2型和*3型是中国人群中最常见的两种等位基因型，分别为rs4244285，681g>a；rs4986893，636g>a的点突变，这些点突变引起cyp2c19基因编码的酶活性丧失，代谢底物的能力减弱，使血药浓度增高，在常规治疗剂量时易引起蓄积中毒。

在中国人群中，cyp2c19*2出现概率为31.47-35％，cyp2c19*3出现概率为5.17-8％，另外，cyp2c19*17亚型为rs12248560，-806c>t的点突变，该突变能够显著提高cyp2c19酶活，代谢底物的能力增强，因此需要增加药物剂量，cyp2c19*17等位基因在中国人群中出现概率为0.43-3％，在亚裔人群出现的概率约为3-21％。

由于cyp2c19基因的多态性所致cyp450酶活不同，从而引起相关药物代谢在个体化之间的差异，导致相关药物对于不同患者的疗效与副作用明显不同。以氯吡格雷为例，和氯吡格雷相关的cyp2c19等位基因中，功能缺失的亚型是常染色体显性遗传的，因为该基因的杂合子中，血小板对氯吡格雷是易感的，这种易感程度介于野生型和功能缺失的亚型之间。

因此，确定cyp2c19的等位基因，能够将服用氯吡格雷的人群分成快代谢，中等代谢和缺乏代谢三类，其中缺乏代谢人群在高加索人种和非洲人种中的频率约为2-5％，在亚洲人种中的频率约15％。此外，cyp2c19*17亚型能够增强该基因的转录，从而显著提高cyp2c19酶活，该亚型的频率约为3-21％，携带该基因型的人群被定义成超快代谢型，通过检测患者cyp2c19基因型，判断患者代谢速率类型，合理调整用药剂量，是提高相关疾病治愈率，减少药物毒副作用的有效途径。

cyp2c9是表达华法林代谢酶的基因，cyp2c9*3导致cyp2c9酶活性降低，与野生型患者相比，携带突变型的个体在治疗初始阶段需要的维持剂量较低，且到达稳态剂量所需时间更长,同时发生抗凝过量(inr>4.0)危及生命的出血事件的风险显著升高。

vkor是华法林作用的靶点，启动子区域-1639g>a的突变可引起vkorc1mrna的表达下降，从而使肝脏中酶的生成也相应地减少，此时只需要很少剂量的华法林就能达到抗凝效果，过量的华法林会导致溶血等严重副反应。

以cyp2c9和vkorc1基因多态性为导向的华法林给药方案可以提高药物的安全性，弥补了常规用药中通过出现不良反应再调整剂量的不足，因此，病人在首次服用华法林之前，检测cyp2c9和vkorc1基因多态性，这对患者的疗效获益及避免出血等不良事件的发生有重要的指导意义。

技术实现要素：

本发明的主要目的是为了提供一种快速检测抗血栓个体化用药基因多态性的试剂盒及方法，涉及与抗血栓个体化用药氯吡格雷与华法林相关基因cyp2c19、cyp2c9、vkorc1基因多态性的试剂盒及方法。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种快速检测抗血栓个体化用药基因多态性的试剂盒，基因多态性包括cyp2c19*2(681g＞a)、*3(636g＞a)、17(-806＞t)、与cyp2c9*2(430c＞t)*3(1075a＞c)及vkorc1-1639g＞a型基因多态性，试剂盒包括样本处理试剂、基因检测试剂、阳性对照品和阴性对照品。

进一步的，基因检测试剂采用pcr8联管单人份预混分装，基因检测试剂包括：cyp2c19野生型基因检测试剂、cyp2c19突变型基因检测试剂、cyp2c9+vkorc1野生型基因检测试剂和cyp2c9+vkorc1突变型基因检测试剂。

进一步的，cyp2c19野生型基因检测试剂包括：

检测cyp2c19681g>a引物对：seqidno.1-seqidno.2；

seqidno.1为cyp2c19681g>a上游引物：

5’-gcaataattttcccactatcattc-3’；

seqidno.2为cyp2c19681g>a下游引物：

5’-caaaatatcactttccataaaag-3’；

检测cyp2c19681g特异性探针seqidno.3；

seqidno.3为cyp2c19681g荧光探针：

5’-荧光基团-tatttcccgggaacct-mgb-nfq-3’；

检测cyp2c19636g>a引物对：seqidno.5-seqidno.6；

seqidno.5为cyp2c19636g>a上游引物：

5’-gatcagcaatttcttaacttgatggaa-3’；

seqidno.6为cyp2c19636g>a下游引物：

5’-aagactgtaagtggtttctcagg-3’；

检测cyp2c19636g特异性探针seqidno.7；

seqidno.7为cyp2c19636g荧光探针：

5’-荧光基团-accccctggatc-mgb-nfq-3’；

检测cyp2c19-806c>t引物对：seqidno.9-seqidno.10；

seqidno.9为cyp2c19-806c>t上游引物：

5’-agtggttctatttaatgtgaagc-3’；

seqidno.10为cyp2c19-806c>t下游引物：

5’-atcgtggcgcattatctct-3’；

检测cyp2c19-806c特异性探针seqidno.11；

seqidno.11为cyp2c19-806c荧光探针：

5’-荧光基团-atcagagatgctttgac-mgb-nfq-3’；

cyp2c19突变型基因检测试剂包括：

检测cyp2c19681g>a引物对：seqidno.1-seqidno.2；

seqidno.1为cyp2c19681g>a上游引物：

5’-gcaataattttcccactatcattc-3’；

seqidno.2为cyp2c19681g>a下游引物：

5’-caaaatatcactttccataaaag-3’；

检测cyp2c19681a特异性探针seqidno.4；

seqidno.4为cyp2c19681a荧光探针：

5’-荧光基团-ttcccaggaacccata-mgb-nfq-3’；

检测cyp2c19636g>a引物对：seqidno.5-seqidno.6；

seqidno.5为cyp2c19636g>a上游引物：

5’-gatcagcaatttcttaacttgatggaa-3’；

seqidno.6为cyp2c19636g>a下游引物：

5’-aagactgtaagtggtttctcagg-3’；

检测cyp2c19636a特异性探针seqidno.8；

seqidno.8为cyp2c19636a荧光探针：

5’-荧光基团-actccctgaatc-mgb-nfq-3’；

检测cyp2c19-806c>t引物对：seqidno.9-seqidno.10；

seqidno.9为cyp2c19-806c>t上游引物：

5’-agtggttctatttaatgtgaagc-3’；

seqidno.10为cyp2c19-806c>t下游引物：

5’-atcgtggcgcattatctct-3’；

检测cyp2c19-806c特异性探针seqidno.12；

seqidno.12为cyp2c19-806t荧光探针：

5’-荧光基团-atcagagatactttgat-mgb-nfq-3’。

进一步的，cyp2c9+vkorc1野生型基因检测试剂包括：

检测cyp2c9430c>t引物对：seqidno.13-seqidno.14；

seqidno.13为cyp2c9430c>t上游引物：

5’-tcatgacgctgcggaatt-3’；

seqidno.14为cyp2c9430c>t下游引物：

5’-acccacccttggtttttctca-3’；

检测cyp2c9430c特异性探针seqidno.15；

seqidno.15为cyp2c9430c荧光探针：

5’-荧光基团-tgaacacggtcctca-mgb-nfq-3’；

检测cyp2c91075a>c引物对：seqidno.17-seqidno.18；

seqidno.17为cyp2c91075a>c上游引物：

5’-ggaagagattgaacgtgtga-3’；

seqidno.18为cyp2c91075a>c下游引物：

5’-tatgaatttggggacttcgaa-3’；

检测cyp2c91075a特异性探针seqidno.19；

seqidno.19为cyp2c91075a荧光探针：

5’-荧光基团-agagatacattgacctt-mgb-nfq-3’；

检测vkorc1-1639g＞a引物对：seqidno.21-seqidno.22；

seqidno.21为vkorc1-1639g＞a上游引物：

5’-gtcaagcaagagaagac-3’；

seqidno.22为vkorc1-1639g＞a游引物：

5’-tgtcttaaactcctgacct-3’；

检测vkorc1-1639g特异性探针seqidno.23；

seqidno.23为vkorc1-1639g荧光探针：

5’-荧光基团-cgcacctggccaat-mgb-nfq-3’；

cyp2c9+vkorc1突变型基因检测试剂包括：

检测cyp2c9430c>t引物对：seqidno.13-seqidno.14；

seqidno.13为cyp2c9430c>t上游引物：

5’-tcatgacgctgcggaatt-3’；

seqidno.14为cyp2c9430c>t下游引物：

5’-acccacccttggtttttctca-3’；

检测cyp2c9430t特异性探针seqidno.16；

seqidno.16为cyp2c9430t荧光探针：

5’-荧光基团-ttgaacacagtcctca-mgb-nfq-3’；

检测cyp2c91075a>c引物对：seqidno.17-seqidno.18；

seqidno.17为cyp2c91075a>c上游引物：

5’-ggaagagattgaacgtgtga-3’；

seqidno.18为cyp2c91075a>c下游引物：

5’-tatgaatttggggacttcgaa-3’；

检测cyp2c91075c特异性探针seqidno.20；

seqidno.20为cyp2c91075c荧光探针：

5’-荧光基团-aagataccttgaccttct-mgb-nfq-3’；

检测vkorc1-1639g＞a引物对：seqidno.21-seqidno.22；

seqidno.21为vkorc1-1639g＞a上游引物：

5’-gtcaagcaagagaagac-3’；

seqidno.22为vkorc1-1639g＞a游引物：

5’-tgtcttaaactcctgacct-3’；

检测vkorc1-1639a特异性探针seqidno.24；

seqidno.24为vkorc1-1639a荧光探针：

5’-荧光基团-tcgcacccggccaat-mgb-nfq-3’；

探针核酸序列5’采用fam、joe、vic、ned和rox中的一种修饰，探针核酸序列3’采用mgb-nfq基团修饰。

进一步的，基因检测试剂还包括：用于内部质控的内参引物对seqidno.25-seqidno.26和内参探针seqidno.27，探针采用taqman探针。

seqidno.25为内参上游引物：

5’-ccttcctgccaccgctgat-3’；

seqidno.26为内参下游引物：

5’-tgccttcgcaaccattccctta-3’

内参探针seqidno.27：

5’-荧光基团-cgctatgctccgcgcgcatcgtctgctc-bhq-3’。

进一步的，基因检测试剂还包括：具有抗pcr酶抑制剂的taqpathproampmastermix预混液；预混液包含经修饰后的hotstart-taq聚合酶、ung酶、rox荧光校准染料、dntp、mgcl2、pcrbuffer。

进一步的，阳性对照品为混合cyp2c19681g、681a、636g、636a、-806c、-806t和cyp2c9430c、430t、1075a、1075c、vkorc1-1639g、-1639a基因质粒dna和内参质粒dna；阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。

一种快速检测抗血栓个体化用药基因多态性的方法，包括如下步骤：

步骤1：取edta抗凝全血样本，取2μl，加入20μl样本处理试剂，在37℃条件下孵育5min；

步骤2：将步骤1所得样本2μl，分别加入到18μl预混分装的cyp2c19野生型、cyp2c19突变型、cyp2c9\vkorc1野生型及cyp2c9\vkorc1突变型基因检测试剂中，混匀后进行pcr扩增检测；

步骤3：设置仪器反应流程和反应参数检测反应；

步骤4：根据同一基因位点野生型和突变型荧光通道ct.值之差△ct.值确定样本基因分型，当检测阳性结果有s型扩增曲线升起，且ct.值小于判定值时，表示无扩增，noct表示无扩增，ct.值按40计。

进一步的，步骤3中，反应参数为：

第1阶段：95℃，10min，1个循环；

第2阶段：95℃，10s，40个循环；

第3阶段：60℃，30s，40个循环，在第3阶段打开荧光通道收集荧光值。

进一步的，基因分型判读结果如下：

当内参ct≤35，△ct.＝ct突变-ct野生，△ct.≥3，基因型别为：cyp2c19681gg、636gg-806cc、cyp2c9430cc、1075aa、vkorc1-1639gg；

当内参ct≤35，△ct.＝ct突变-ct野生，-3＜△ct.＜3，基因型别为：cyp2c19681ga、636ga、-806ct、cyp2c9430ct、1075ac、vkorc1-1639ga；

当内参ct≤35，△ct.＝ct突变-ct野生，△ct.≤-3，基因型别为：cyp2c19681aa、636aa、-806tt、cyp2c9430tt、1075cc、vkorc1-1639aa。

本发明的有益技术效果：本发明提供的快速检测抗血栓个体化用药基因多态性的试剂盒及方法，试剂盒包括用于样本快速处理的试剂、单管预混完成的基因检测试剂、混合检测靶基因质粒dna的阳性对照品，不含靶基因的阴性对照品，基因检测试剂具有较强的抗pcr抑制物能力和多重pcr功能，检测时无需gdna提取纯化、只需将全血样本细胞快速裂解处理后即可加入单管预混的基因检测试剂，不同的被测靶基因分别采用不同的引物对进行基因扩增，并采用不同的荧光染料基团标记的探针对扩增产物进行实时检测分析，实现一个反应体系同时对多基因变异的检出，在保证检出特异性和灵敏的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。

附图说明

图1和图2本发明检测结果为cyp2c19*1/*1；

图3和图4为本发明检测结果为cyp2c19*1/*2；

图5和图6为本发明检测结果为cyp2c19*1/*3；

图7和图8为本发明检测结果为cyp2c19*1/*17；

图9和图10为本发明检测结果为cyp2c19*2/*2；

图11和图12为本发明检测结果为cyp2c19*2/*3；

图13和图14为本发明检测结果为cyp2c19*2/*17；

图15和图16为本发明检测结果为cyp2c19*3/*3；

图17和图18为本发明检测结果为cyp2c19*3/*17；

图19和图20为本发明检测结果为cyp2c19*17/*17；

图21和图22为本发明检测结果为cyp2c9*1/*1、vkorc1-1639gg；

图23和图24为本发明检测结果为cyp2c9*1/*2、vkorc1-1639gg；

图25和图26为本发明检测结果为cyp2c9*2/*2、vkorc1-1639gg；

图27和图28为本发明的检测结果为cyp2c9*1/*3、vkorc1-1639gg；

图29和图30为本发明检测结果为cyp2c9*3/*3、vkorc1-1639gg；

图31和图32为本发明检测结果为cyp2c9*1/*1、vkorc1-1639ga；

图33和图34为本发明检测结果为cyp2c9*1/*1、vkorc1-1639aa；

图35和图36为本发明检测结果为cyp2c9*1/*2、vkorc1-1639ga；

图37和图38为本发明检测结果为cyp2c9*2/*2、vkorc1-1639ga；

图39和图40为本发明检测结果为cyp2c9*2/*2、vkorc1-1639aa；

图41和图42为本发明检测结果为cyp2c9*1/*3、vkorc1-1639ga；

图43和图44为本发明检测结果为cyp2c9*1/*3、vkorc1-1639aa；

图45和图46为本发明检测结果为cyp2c9*3/*3、vkorc1-1639ga；

图47和图48为本发明检测结果为cyp2c9*3/*3、vkorc1-1639aa。

具体实施方式

为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

在本实施例中，是根据图形结果判读基因型，一个基因型结果判读是根据野生型体系和突变型体系对应着来判读的，因此，是两个图决定一种基因型。

本实施例提供的快速检测抗血栓个体化用药基因多态性的试剂盒，基因多态性包括cyp2c19*2(681g＞a)、*3(636g＞a)、17(-806＞t)、与cyp2c9*2(430c＞t)*3(1075a＞c)及vkorc1-1639g＞a型基因多态性，试剂盒包括用于人全血样本快速处理的样本处理试剂、经预混单人份分装的基因检测试剂，分别包括cyp2c19野生型基因检测试剂、cyp2c19突变型基因检测试剂和cyp2c9+vkorc1野生型基因检测试剂、cyp2c9+vkorc1突变型基因检测试剂，阳性对照品和阴性对照品。

在本实施例中，cyp2c19野生型基因检测试剂包括：

检测cyp2c19681g>a引物对：seqidno.1-seqidno.2；

检测cyp2c19681g特异性探针seqidno.3；

检测cyp2c19636g>a引物对：seqidno.5-seqidno.6；

检测cyp2c19636g特异性探针seqidno.7；

检测cyp2c19-806c>t引物对：seqidno.9-seqidno.10；

检测cyp2c19-806c特异性探针seqidno.11；

在本实施例中，cyp2c19突变型基因检测试剂包括：

检测cyp2c19681g>a引物对：seqidno.1-seqidno.2；

检测cyp2c19681a特异性探针seqidno.4；

检测cyp2c19636g>a引物对：seqidno.5-seqidno.6；

检测cyp2c19636a特异性探针seqidno.8；

检测cyp2c19-806c>t引物对：seqidno.9-seqidno.10；

检测cyp2c19-806c特异性探针seqidno.12。

在本实施例中，cyp2c9+vkorc1野生型基因检测试剂包括：

检测cyp2c9430c>t引物对：seqidno.13-seqidno.14；

检测cyp2c9430c特异性探针seqidno.15；

检测cyp2c91075a>c引物对：seqidno.17-seqidno.18；

检测cyp2c91075a特异性探针seqidno.19；

检测vkorc1-1639g＞a引物对：seqidno.21-seqidno.22；

检测vkorc1-1639g特异性探针seqidno.23；

在本实施例中，cyp2c9+vkorc1突变型基因检测试剂包括：

检测cyp2c9430c>t引物对：seqidno.13-seqidno.14；

检测cyp2c9430t特异性探针seqidno.16；

检测cyp2c91075a>c引物对：seqidno.17-seqidno.18；

检测cyp2c91075c特异性探针seqidno.20；

检测vkorc1-1639g＞a引物对：seqidno.21-seqidno.22；

检测vkorc1-1639a特异性探针seqidno.24；

探针核酸序列5’采用fam、joe、vic、ned和rox中的一种修饰，探针核酸序列3’采用mgb-nfq基团修饰。

在本实施例中，基因检测试剂还包括：用于内部质控的内参引物对seqidno.25-seqidno.26和内参探针seqidno.27，探针采用taqman探针。

seqidno.25为内参上游引物：

5’-ccttcctgccaccgctgat-3’；

seqidno.26为内参下游引物：

5’-tgccttcgcaaccattccctta-3’

内参探针seqidno.27：

5’-荧光基团-cgctatgctccgcgcgcatcgtctgctc-bhq-3’。

在本实施例中，基因检测试剂还包括：具有抗pcr酶抑制剂的taqpathproampmastermix预混液；预混液包含经修饰后的hotstart-taq聚合酶、ung酶、rox荧光校准染料、dntp、mgcl2、pcrbuffer。

在本实施例中，阳性对照品为混合cyp2c19681g、681a、636g、636a、-806c、-806t和cyp2c9430c、430t、1075a、1075c、vkorc1-1639g、-1639a基因质粒dna和内参质粒dna；阴性对照品为不含靶基因和内参基因的超纯水。

本实施例还提供了快速检测抗血栓个体化用药基因多态性的方法，包括如下步骤：

步骤1：取edta抗凝全血样本，取2μl，加入20μl样本处理试剂，在37℃条件下孵育5min；

步骤2：将步骤1所得样本2μl，分别加入到18μl预混分装的cyp2c19野生型、cyp2c19突变型、cyp2c9\vkorc1野生型及cyp2c9\vkorc1突变型基因检测试剂中，混匀后进行pcr扩增检测；

步骤3：设置仪器反应流程和反应参数检测反应，反应参数为：

第1阶段：95℃，10min，1个循环；

第2阶段：95℃，10s，40个循环；

第3阶段：60℃，30s，40个循环，在第3阶段打开荧光通道收集荧光值；

步骤4：根据同一基因位点野生型和突变型荧光通道ct.值之差△ct.值确定样本基因分型，当检测阳性结果有s型扩增曲线升起，且ct.值小于判定值时，表示无扩增，noct表示无扩增，ct.值按40计。

在本实施例中，本实施例针对现有技术检测cyp2c19*2、*3、*17、cyp2c92、*3、vkorc1-1639g＞a型基因多态性时对样本处理要求高、检测周期长、操作复杂、成本高和特异性不强等不足，提供了一种基于实时荧光定量pcr技术平台的检测试剂盒和方法。

在本实施例中，本实施例为提升检测的特异性和灵敏性，采用根据靶基因序列设计的特异性扩增引物对和mgb-nfq荧光探针，进行特异扩增和实时检测分析，使其能特异性第检出cyp2c19*2(681g＞a)、*3(636g＞a)、17(-806＞t)、与cyp2c9*2(430c＞t)*3(1075a＞c)及vkorc1-1639g＞a型基因突变。引物和探针设计如下：

cyp2c19681g>a上游引物：

5’-gcaataattttcccactatcattc-3’(seqidno.1)

cyp2c19681g>a下游引物：

5’-caaaatatcactttccataaaag-3’(seqidno.2)

cyp2c19681g荧光探针：

5’-荧光基团-tatttcccgggaacct-mgb-nfq-3’(seqidno.3)

cyp2c19681a荧光探针：

5’-荧光基团-ttcccaggaacccata-mgb-nfq-3’(seqidno.4)

cyp2c19636g>a上游引物：

5’-gatcagcaatttcttaacttgatggaa-3’(seqidno.5)

cyp2c19636g>a下游引物：

5’-aagactgtaagtggtttctcagg-3’(seqidno.6)

cyp2c19636g荧光探针：

5’-荧光基团-accccctggatc-mgb-nfq-3’(seqidno.7)

cyp2c19636a荧光探针：

5’-荧光基团-actccctgaatc-mgb-nfq-3’(seqidno.8)

cyp2c19-806c>t上游引物：

5’-agtggttctatttaatgtgaagc-3’(seqidno.9)

cyp2c19-806c>t下游引物：

5’-atcgtggcgcattatctct-3’(seqidno.10)

cyp2c19-806c荧光探针：

5’-荧光基团-atcagagatgctttgac-mgb-nfq-3’(seqidno.11)

cyp2c19-806t荧光探针：

5’-荧光基团-atcagagatactttgat-mgb-nfq-3’(seqidno.12)

cyp2c9430c>t上游引物：

5’-tcatgacgctgcggaatt-3’(seqidno.13)

cyp2c9430c>t下游引物：

5’-acccacccttggtttttctca-3’(seqidno.14)

cyp2c9430c荧光探针：

5’-荧光基团-tgaacacggtcctca-mgb-nfq-3’(seqidno.15)

cyp2c9430t荧光探针：

5’-荧光基团-ttgaacacagtcctca-mgb-nfq-3’(seqidno.16)

cyp2c91075a>c上游引物：

5’-ggaagagattgaacgtgtga-3’(seqidno.17)

cyp2c91075a>c下游引物：

5’-tatgaatttggggacttcgaa-3’(seqidno.18)

cyp2c91075a荧光探针：

5’-荧光基团-agagatacattgacctt-mgb-nfq-3’(seqidno.19)

cyp2c91075c荧光探针：

5’-荧光基团-aagataccttgaccttct-mgb-nfq-3’(seqidno.20)

vkorc1-1639g＞a上游引物：

5’-gtcaagcaagagaagac-3’(seqidno.21)

vkorc1-1639g＞a游引物：

5’-tgtcttaaactcctgacct-3’(seqidno.22)

vkorc1-1639g荧光探针：

5’-荧光基团-cgcacctggccaat-mgb-nfq-3’(seqidno.23)

vkorc1-1639a荧光探针：

5’-荧光基团-tcgcacccggccaat-mgb-nfq-3’(seqidno.24)

内参上游引物：

5’-ccttcctgccaccgctgat-3’(seqidno.26)

内参下游引物：

5’-tgccttcgcaaccattccctta-3’(seqidno.27)

内参探针：

5’-荧光基团-cgctatgctccgcgcgcatcgtctgctc-bhq-3’(seqidno.28)

在本实施例中，本实施例针对样本需要进行gdna提取纯化等耗时、耗力、耗费的操作，配套了样本快速处理试剂，极大地降低了操作步骤和操作时间，具体地处理方法为：取2μledta抗凝全血样本，加入到20μl样本处理试剂，在37℃条件下孵育5min即完成处理。

在本实施例中，本实施例针对样本处理方式的改变和多重pcr反应体系的要求，采用含经修饰的hotstart-taq聚合酶和优化的缓冲体系的pcr预混液taqpathproampmastermix，使检测体系对于样本的抗抑制能力大大提升，使基因检测试剂具备高效多重pcr反应能力，预混液含稳定试剂成分，有利于混合状态下的试剂长期稳定保存，增强了试剂的稳定性。

在本实施例中，本实施例针对每次检测，每个检测体系只能进行单重pcr反应，每个反应体系只能检测一个基因位点多态性的不足，基因检测试剂将多对引物和多条经不同荧光染料基团修饰的特异性荧光探针与pcr预混液配制预混成一个反应体系，利用taqpathproampmastermix预混液多重反应能力，使不同靶基因在多对特异性引物结合下高效多重pcr扩增，并利用标记不同荧光染料基团的mgb-nfq和taqman-bhq荧光探针对目标产物进行实时检测分析。所有检测引物和特异性探针配制成一个检测试剂，预混单管包装，方便检测，实现了一个反应体系的多基因变异分析。减低生产和检测成本的同时提升了检测效率，检测试剂组成成分如表1所示：

表1检测试剂组成成分如下

在本实施例中，本实施例针对检测质控需求，设置了阳性对照品和阴性对照品。阳性对照品为混合cyp2c19681g、681a、636g、636a、-806c、-806t和cyp2c9430c、430t、1075a、1075c、vkorc1-1639g、-1639a基因及内参基因质粒的混合核酸溶液，浓度0.01-1pg/μl，空白对照是不含基因核酸的超纯水。检测时视对照品为待测样本，加入基因检测试剂，阳性对照品各检测信号和内参信号曲线应呈s型升起，且对应ct.值小于阳性判定值。空白对照品应无曲线升起，且对应ct.值大于阳性判定值，否则检测失效，结果不可信。

在本实施例中，本实施例的检测流程：

第1步：样本快速处理，取edta抗凝全血样本，取2μl，加入20μl样本处理试剂，在37℃条件下孵育5min；

第2步：将第1步所得样本2μl，分别加入到18μl预混分装的基因检测试剂中，混匀后进行pcr扩增；

第3步：设置仪器反应流程和反应参数用于检测反应，反应参数为：

第1阶段：95℃，10min，1个循环；

第2阶段：95℃，10s，40个循环；

第3阶段：60℃，30s，40个循环，在第3阶段打开荧光通道收集荧光值；

第4步：根据同一基因位点野生型和突变型荧光通道ct.值之差△ct.值确定样本基因分型，检测阳性结果应有典型s型扩增曲线升起，且ct.值小于判定值。

检测时设置仪器反应参数，打开仪器相应荧光收集通道。

反应参数为：

第1阶段：95℃，10min，1个循环；

第2阶段：95℃，10s，40个循环；

第3阶段：60℃，30s，40个循环。

在第3阶段打开荧光通道收集荧光值，仪器根据通道荧光信号值变化情况，生产扩增曲线并获得扩增ct.值，阳性值判定如表2所示：

表2阳性值判定

在本实施例中，将金标准sanger测序法鉴定为cyp2c19*1/*1、*1/*2、*1/*3、*1/*17、*2/*2、2/*3、*2/*17、*3/*3、*3/*17、*17/*17基因样本，加入cyp2c19野生型和突变型基因检测试剂进行同步盲测。

在本实施例中，将金标准sanger测序法鉴定为cyp2c9*1/*1、*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3、3/*3、vkorc1-1639gg、vkorc1-1639ga、vkorc1-1639aa基因样本，加入cyp2c9+vkorc1野生型和突变型基因检测试剂进行同步盲测。

在本实施例中，如图1-图48所示，最后揭盲，与金标准结果对比，结果本试剂盒及检测方法测得的结果均与测序法结果相符。

综上所述，在本实施例中，本实施例提供的快速检测抗血栓个体化用药基因多态性的试剂盒及方法，试剂盒包括用于样本快速处理的试剂、单管预混完成的基因检测试剂、混合检测靶基因质粒dna的阳性对照品，不含靶基因的阴性对照品，基因检测试剂具有较强的抗pcr抑制物能力和多重pcr功能，检测时无需gdna提取纯化、只需将全血样本细胞快速裂解处理后即可加入单管预混的基因检测试剂，不同的被测靶基因分别采用不同的引物对进行基因扩增，并采用不同的荧光染料基团标记的探针对扩增产物进行实时检测分析，实现一个反应体系同时对多基因变异的检出，在保证检出特异性和灵敏的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。

以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。