本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种供药学应用的蛋白酶变体。
背景技术：
蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。按其降解多肽的方式分成内肽酶和端肽酶两类。前者可把大分子量的多肽链从中间切断，形成分子量较小的朊和胨；后者又可分为羧肽酶和氨肽酶，它们分别从多肽的游离羧基末端或游离氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸。
蛋白水解酶催化多肽或蛋白质水解的酶的统称，简称蛋白酶。广泛分部于动物、植物以及细菌当中，种类繁多，在动物的消化道以及体内各种细胞的溶酶体内含量尤为丰富。蛋白酶对机体的新陈代谢以及生物调控起重要作用。分子量一般在2-3万左右。蛋白酶按水解底物的部位可分为内肽酶以及外肽酶，前者水解蛋白质中间部分的肽键，后者则自蛋白质的氨基或羧基末端逐步降解氨基酸残基。
随着生物基因工程在基础研究领域和应用领域的不断进步，采用一定手段对蛋白酶进行处理，可以使之应用到社会中很多方面，酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点，偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。
技术实现要素：
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种供药学应用的蛋白酶变体，解决了目前酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点，偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果的问题。
(二)技术方案
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种供药学应用的蛋白酶变体，其包含序列表中的seqidno.1氨基酸序列，所述氨基酸序列去除原基因n端前25个氨基酸酶原激活肽段中的前20个氨基酸，n端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点，缩短后的酶原序列经ecori和noti双酶切并插入ppic9k相应的单克隆位点。
所述蛋白酶作为起始分子，通过片段化、缺失诱变、插入诱变、或取代诱变而得，并且包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265或266个连续相连氨基酸的长度上相应于所述起始分子的氨基酸序列，其中所述起始分子中含有的氨基酸取代r99e或r99d与氨基酸取代s3t、v4i和v199i的组合依然存在，所述蛋白酶的降解由20s核心颗粒中的β亚基进行，其机制被认为是苏氨酸依赖的亲核攻击，这一机制可能需要有一个结合的水分子参与活性的苏氨酸上羟基的去质子化，降解发生在核心颗粒中间的两个β环内的孔道里，一般不生成部分降解的产物，而是将底物蛋白完全降解为长度一定的肽段，肽段的长度一般为7-9个残基。
优选的，所述蛋白酶活性区氨基酸所在2环及侧翼链，以糖基化识别序列asn-xaa-ser/thr为模板，选取距离活性位点氨基酸asp89较近的82位asn作为拟糖基化位点。
优选的，所述序列为seqidno.1的氨基酸来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的位置36、42、47、56、61、69、87.96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268相关联的一或多个位置引入单个或多个氨基酸取代，其中所述蛋白酶包含根据seqidno.1计数的氨基酸取代r99e或r99d与氨基酸取代s3t、v4i和v199i的组合。
优选的，所述氨基酸酶原激活肽是一种具有多种生物活性的多肽，包括pacap-38和paca-27两种，分别由38和27个氨基酸组成，后者的氨基酸顺序与pacap-38的n端1～27个氨基酸残基完全相同。
优选的，所述蛋白酶作为起始分子降解的蛋白质会先被连接上泛素作为标记，即蛋白质上的一个赖氨酸与泛素之间形成共价连接，泛素被转移到e1的活性中心的半胱氨酸残基上，并伴随着第二个泛素分子的腺苷酸化。
优选的，所述β亚基具有共同的降解机制催化活性，而各个β亚基对于底物的特异性却略有不同，并且每一个具有催化活性的β亚基也都含有一个降解所必需的保守的赖氨酸。
(三)有益效果
本发明的有益效果在于：
1、该供药学应用的蛋白酶变体，通过采用n端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点，缩短后的酶原序列经ecori和noti双酶切并插入ppic9k相应的单克隆位点，以及以糖基化识别序列asn-xaa-ser/thr为模板，选取距离活性位点氨基酸asp89较近的82位asn作为拟糖基化位点，直接采用双酶切并插入ppic9k相应的单克隆位点进行标记酶切，从而在根本上提高了蛋白酶变体在氨基酸层面的酶切处理效率，副产物更少，使之在药学上经过适配性连接之后的应用更加广泛，并且使得所得蛋白酶变体的适应性更高。
2、该供药学应用的蛋白酶变体，蛋白酶的降解由20s核心颗粒中的β亚基进行，其机制被认为是苏氨酸依赖的亲核攻击，这一机制可能需要有一个结合的水分子参与活性的苏氨酸上羟基的去质子化，当结合到微管中时，微管蛋白积累了许多翻译后修饰，其中许多是这些蛋白质所特有的，这些修改包括detyrosination，乙酰化，polyglutamylation，polyglycylation，磷酸化，泛素化，sumo化，和棕榈酰化，对一些微管中的乙酰化科学研究具备了极大地借鉴意义，特别是α-微管蛋白n-乙酰转移酶(atat1)，它被证明在许多生物和分子功能中发挥重要作用，它与人类神经系统疾病密切相关，可以针对性的应用到神经系统药物制备上。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种供药学应用的蛋白酶变体，其包含序列表中的seqidno.1氨基酸序列，氨基酸序列去除原基因n端前25个氨基酸酶原激活肽段中的前20个氨基酸，n端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点，缩短后的酶原序列经ecori和noti双酶切并插入ppic9k相应的单克隆位点，蛋白酶活性区氨基酸所在2环及侧翼链，以糖基化识别序列asn-xaa-ser/thr为模板，选取距离活性位点氨基酸asp89较近的82位asn作为拟糖基化位点，通过采用n端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点，缩短后的酶原序列经ecori和noti双酶切并插入ppic9k相应的单克隆位点，以及以糖基化识别序列asn-xaa-ser/thr为模板，选取距离活性位点氨基酸asp89较近的82位asn作为拟糖基化位点，直接采用双酶切并插入ppic9k相应的单克隆位点进行标记酶切，从而在根本上提高了蛋白酶变体在氨基酸层面的酶切处理效率，副产物更少，使之在药学上经过适配性连接之后的应用更加广泛，并且使得所得蛋白酶变体的适应性更高。
蛋白酶作为起始分子，通过片段化、缺失诱变、插入诱变、或取代诱变而得，并且包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265或266个连续相连氨基酸的长度上相应于起始分子的氨基酸序列，其中起始分子中含有的氨基酸取代r99e或r99d与氨基酸取代s3t、v4i和v199i的组合依然存在，序列为seqidno.1的氨基酸来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的位置36、42、47、56、61、69、87.96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268相关联的一或多个位置引入单个或多个氨基酸取代，其中蛋白酶包含根据seqidno.1计数的氨基酸取代r99e或r99d与氨基酸取代s3t、v4i和v199i的组合，蛋白酶的降解由20s核心颗粒中的β亚基进行，其机制被认为是苏氨酸依赖的亲核攻击，这一机制可能需要有一个结合的水分子参与活性的苏氨酸上羟基的去质子化，当结合到微管中时，微管蛋白积累了许多翻译后修饰，其中许多是这些蛋白质所特有的，这些修改包括detyrosination，，乙酰化，polyglutamylation，polyglycylation，磷酸化，泛素化，sumo化，和棕榈酰化，对一些微管中的乙酰化科学研究具备了极大地借鉴意义，特别是α-微管蛋白n-乙酰转移酶(atat1)，它被证明在许多生物和分子功能中发挥重要作用，它与人类神经系统疾病密切相关，可以针对性的应用到神经系统药物制备上，氨基酸酶原激活肽是一种具有多种生物活性的多肽，包括pacap-38和paca-27两种，分别由38和27个氨基酸组成，后者的氨基酸顺序与pacap-38的n端1～27个氨基酸残基完全相同，蛋白酶的降解由20s核心颗粒中的β亚基进行，其机制被认为是苏氨酸依赖的亲核攻击，这一机制可能需要有一个结合的水分子参与活性的苏氨酸上羟基的去质子化，蛋白酶作为起始分子降解的蛋白质会先被连接上泛素作为标记，即蛋白质上的一个赖氨酸与泛素之间形成共价连接，泛素被转移到e1的活性中心的半胱氨酸残基上，并伴随着第二个泛素分子的腺苷酸化，降解发生在核心颗粒中间的两个β环内的孔道里，一般不生成部分降解的产物，而是将底物蛋白完全降解为长度一定的肽段，肽段的长度一般为7-9个残基，β亚基具有共同的降解机制催化活性，而各个β亚基对于底物的特异性却略有不同，并且每一个具有催化活性的β亚基也都含有一个降解所必需的保守的赖氨酸。
使用上述机理所得蛋白酶变体的溶痂作用主要体现在对于烧伤创面形成的痂皮进行软化清除，尤其对深度烧伤的表皮，再植需要自发或主动去除焦痂，而蛋白酶能选择性地除去死皮，使新皮移植得以尽早进行，因此，溶痂对于烧伤创面的修复具有很重要作用，蛋白酶变体对心血管疾病的防治有益的蛋白水解酶，它能够抑制血小板聚集引起的心脏病发作和中风，缓解心绞痛症状，缓和动脉收缩，加速纤维蛋白原的分解。
另外，所得蛋白酶具有免疫刺激作用，能控制免疫反应等特点，因此在医学上的应用较为广泛，engwerda等通过在体内外实验研究发现蛋白酶可以增强和抑制t细胞的免疫反应231，蛋白酶还能抑制毒素分泌，降低毒素结合活性并能抑制热不稳定毒素(l)、霍乱毒素(ct)及热稳定毒素(st)的分泌效应24，另外，蛋白酶其不受胃肠道酸和消化酶的破坏，口服吸收性好，生物利用率高，且对肠道微生物体系没有不良作用，在治疗动物腹泻、预防和治疗疾病方面起到重要作用。
蛋白酶变体对于免疫缺失的个体具有激活炎症反应的潜力，因此蛋白酶在各种组织中能有效地治疗炎症和水肿(包括血栓静脉炎、骨骼肌损伤、血肿、口腔炎、糖尿病人溃疡及运动损伤)，也能在体外激活鼠巨噬细胞和自然杀伤细胞，含有蛋白酶的混合物(胰蛋白酶芸香苷)在疗效和安全性方面优于类固醇的消炎药，蛋白酶在治疗运动系统伤痛方面能明显改善患者症状，药物耐受性好，将蛋白酶与抗生素联用，能提高其疗效，使用抗生素加用蛋白酶肠溶片治疗慢性前列腺炎疗效明显优于单用抗生素，动物实验表明蛋白酶能促进不同药物渗透到组织和器官中增加血和尿中抗生素水平，蛋白酶促进吸收，增强病变组织的通透性，从而促进抗生素到达感染部位，使靶器官的血药浓度提高，达到增强药物效应的作用并无明显，蛋白酶作为抗生素治疗的辅助用药，有利于提高药效，蛋白酶与其他药物联用也能提高药效，综上所述，本专利所的蛋白酶变体在药学应用方面更加广泛。
以上的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。