鸭疫里默氏菌特异性PCR引物对、PCR检测方法及试剂盒与流程

本发明属于兽医微生物学分子检测技术领域，更具体的，涉及一种简单快速的鸭疫里默氏菌pcr检测试剂盒及其使用方法，适合于鸭疫里默氏菌临床可疑样本的分子检测和诊断。

背景技术：

鸭疫里默氏杆菌病，又称鸭传染性浆膜炎，是由鸭疫里默氏杆菌感染引起的侵害雏鸭的一种急性败血性传染病，以全身浆膜面发生纤维素性炎症为特征，其发病率高达90％以上，死亡率高达75％以上，严重影响养鸭业健康稳定发展，其病变的主要特征是心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎及部分病例出现关节炎为特征，是目前鸭、鹅常见的一种细菌病。常规pcr检测方法特异性高，敏感性强，可以避免血清型的限制，达到快速检测鸭疫里默氏菌的目的，因此，本发明提供一种简单快速的鸭特异性的pcr检测试剂盒及其使用方法，可用于鸭疫里默氏菌的快速检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于鸭疫里默氏菌16srrna序列的pcr引物对、pcr检测方法及试剂盒；本发明选择特异性的扩增鸭疫里默氏菌16srrna片段的引物，并优化了退火温度和反应条件，具有灵敏度高、特异性强的优点，可直接从鸭疫里默氏菌菌液和菌液上清中扩增出特异性片段，适合临床样本分子检测和诊断；利用本发明可简单、快速的检测鸭疫里默氏菌。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现的，鸭疫里默氏菌特异性pcr引物对，其核苷酸序列为：

上游引物：5’-ggaggcagcagtgaggaata-3’，

下游引物：5’-ggaggcagcagtgaggaata-3’；

扩增片段为702bp，用于鸭疫里默氏菌特异性扩增检测，其核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的，鸭疫里默氏菌pcr检测方法：

(1)利用权利要求1所述的引物对，对待测细菌菌液样本或待测菌液上清样本进行pcr扩增；

(2)将pcr扩增产物采用1-2％的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下观察到702bp处单一扩增条带，说明待检测样本中含有鸭疫里默氏菌。否则，表明待测样品中无鸭疫里默氏菌。

优选的，所述pcr扩增反应体系为25μl：鸭疫里默氏菌特异性引物对1μl，引物对的工作浓度为10μm；待测样品模板1-2μl；2倍pcr预混试剂12μl；ddh2o10-11μl。

优选的，所述pcr扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；共35个循环，72℃延伸10min，降温至16℃。

优选的，所述菌液上清的制备，包括如下步骤：

(1)挑取疑似鸭疫里默氏菌菌株，加入到添加有5％血清的胰蛋白胨大豆肉汤tsb培养液中，37℃摇床中过夜培养；

(2)用移液器吸取步骤1过夜培养的疑似鸭疫里默氏菌1ml，放入到1.5ml的离心管中，100℃加热10min；

(3)将步骤2中1.5ml的离心管放入离心机中，12000转/分钟离心10分钟，取上清。

本发明的第三个目的是通过以下技术方案实现的，基于鸭疫里默氏菌16srrna序列的pcr检测试剂盒，所述试剂盒含有如seqidno.1和seqidno.2所示的引物对。

优选的，基于鸭疫里默氏菌16srrna序列的pcr检测试剂盒，可直接从鸭疫里默氏菌液或菌液上清中扩增出特异性片段，其扩增出的特异性片段序列如seqidno.3所示。

优选的，所述试剂盒含有2倍pcr预混试剂(2×premix)；

优选的，所述试剂盒还含有阳性对照质粒dna和阴性对照h2o；

优选的，所述试剂盒采用25μl反应体系，具体为：

优选的，所述质粒dna阳性对照为鸭疫里默氏菌特异性的702bp的pcr产物与pgm-t载体的重组质粒。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明公开了一种基于鸭疫里默氏菌16srrna的简单、快速的鸭疫里默氏菌检测试剂盒及其使用方法，通过该方法检测鸭疫里默氏菌，不需提取细菌的基因组dna，可直接从鸭疫里默氏菌的菌液或菌液上清中扩增出特异性片段，避免了采用传统鉴定提取dna的步骤，所需时间短，检测成本低，准确性高，降低了检测成本。本发明的检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，结果判定简单。

附图说明

图1，本发明的pcr方法建立检测图；m:dl2000marker1：702bp特异性扩增产物；2：阴性对照(h20)。

图2，本发明的pcr方法特异性检测图；m:dl2000marker1：鸭疫里默氏菌标准株菌液2：大肠杆菌标准株菌液3：沙门氏菌标准株菌液4：鸭疫里默氏菌标准株菌液上清5：大肠杆菌标准株菌液上清6：沙门氏菌标准株菌液上清7：阳性对照(质粒dna)8：阴性对照(h2o)。

图3，鸭疫里默氏菌pcr检测方法灵敏度评价图；m:dl2000marker1：稀释1000000倍的质粒dna2：稀释100000倍的质粒dna3：稀释10000倍的质粒dna4：稀释1000倍的质粒dna5：稀释100的质粒dna6：稀释10倍的质粒dna7：质粒dna原液8：阴性对照(h2o)

图4，鸭疫里默氏菌pcr检测试剂盒应用图；m:dl2000marker1：阳性对照(质粒dna)2：阴性对照(h2o)3：鸭疫里默氏菌疑似菌株1菌液4：鸭疫里默氏菌疑似菌株2菌液5：鸭疫里默氏菌疑似菌株3菌液6：鸭疫里默氏菌疑似菌株4菌液7：鸭疫里默氏菌疑似菌株1菌液上清8：鸭疫里默氏菌疑似菌株2菌液上清9：鸭疫里默氏菌疑似菌株3菌液上清10：鸭疫里默氏菌疑似菌株4菌液上清；

图5，鸭疫里默氏菌pcr检测试剂盒结构示意图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实例1：鸭疫里默氏菌pcr方法的建立

设计特异性扩增鸭疫里默氏菌的引物对：通过生物信息学分析从genbank中查找鸭疫里默氏菌标准菌株atcc11845的16srrna序列(genbankno:nr_026025.1)，将之作为鸭疫里默氏菌检测靶基因。

(1)引物设计

将该鸭疫里默氏菌标准菌株atcc11845的16srrna序列输入到引物设计软件primerpremier5.0中设计引物，设置产物大小范围为100-1000bp，从备选引物对中选择出引物，引物序列如下(引物由上海英骏生物技术有限公司合成)：

上游引物：5’-ggaggcagcagtgaggaata-3’(seqidno.1)

下游引物：5’-ggaggcagcagtgaggaata-3’(seqidno.2)

(2)菌液或菌液上清制备

取鸭疫里默氏菌标准株1μl，加入到添加有5％血清的tsb(胰蛋白胨大豆肉汤)培养液中，37℃摇床中过夜培养。用移液器吸取过夜培养的鸭疫里默氏菌1ml，放入到1.5ml的离心管中，100℃加热10min。将装有过夜培养的鸭疫里默氏菌液的1.5ml的离心管放入离心机中，12000转/分钟离心10分钟，取上清。

(3)pcr检测

pcr反应体系为25μl：鸭疫里默氏菌特异性引物对1μl，引物对的工作浓度为10μm；模板(菌液或菌液上清1-2μl)；2倍pcr预混试剂(2×premix)12μl；ddh2o10-11μl。pcr反应条件为：①94℃变性5min，②94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；③72℃延伸10min。

(4)判断标准

所述判断标准具体为：取pcr扩增产物10μl加2μl6×loadingbuffer，在1-2％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，在紫外灯照射下进行观察，如果电泳结果出现相应的702bp单一扩增条带，则说明样品中含有鸭疫里默氏菌；如果没有出现相应的702bp单一扩增条带，则样品中不含有鸭疫里默氏菌。

结果：取pcr扩增产物10μl加2μl6×loadingbuffer，采用1-2％的琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯照射下观察到702bp单一扩增条带，说明所建立的pcr方法能检测鸭疫里默氏菌。

实施例2，鸭疫里默氏菌pcr检测试剂盒的特异性

利用实施例1中建立的鸭疫里默氏菌特异性pcr检测方法对鸭疫里默氏菌标准株(atcc11845)，大肠杆菌标准株(cmcc44102)和沙门氏菌标准株(50336)的菌液和菌液上清进行检测，结果鸭疫里默氏菌菌液和菌液上清均呈阳性，大肠杆菌标准株和沙门氏菌标准株的菌液和菌液上清均呈阴性结果。通过本实施例说明，所建立的鸭疫里默氏菌的pcr检测方法在鉴定细菌中具有属特异性。

实施例3，鸭疫里默氏菌pcr检测方法灵敏度评价

以实施例1获得的702bp产物与pgm-t载体连接并转化获得重组质粒，经过od260/280的测定，重组质粒浓度为68ng/μl，用无菌水做10倍梯度稀释，共稀释7个梯度，每个梯度分别取1μl加入pcr反应体系，按照实施例1步骤(3)中方法对质粒dna模板进行pcr扩增检测。取pcr扩增产物10μl，在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像仪中观察凝胶电泳结果如图3所示。由图3可知，在第3条泳道可以看到清晰的条带，所对应质粒dna浓度68pg，具有极高的灵敏性。

实施例4，鸭疫里默氏菌pcr检测试剂盒的应用

利用实施例1中建立的鸭疫里默氏菌特异性pcr检测方法对分离的4株疑似鸭疫里默氏菌临床分离株进行检测，同时设阳性对照和阴性对照，比较试验结果。

结果：利用实施例1建立的鸭疫里默氏菌特异性pcr检测方法，4株疑似鸭疫里默氏菌的菌液和菌液上清中均呈阳性结果，经测序并与鸭疫里默氏菌标准株序列比对，测序结果与鸭疫里默氏菌标准株的一致性达99％，通过本实施证明，所建立的鸭疫里默氏菌的特异性pcr方法具有非常高的可靠性。

如图5所示，一种鸭疫里默氏菌pcr检测试剂盒，包括盒体6，盒体6内的试剂包括：鸭疫里默氏菌检测的特异性pcr引物对1、2倍pcr预混试剂2、质粒dna阳性对照3、阴性对照h2o4、dna分子量标准溶液5。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。