一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产L-哌啶甲酸的方法与流程

本发明属于全细胞催化、l-哌啶甲酸生产、材料吸附分离领域，涉及一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产l-哌啶甲酸的方法。

背景技术：

l-哌啶甲酸作为含氮杂环化合物，是多种免疫抑制剂等药物的关键前体。这些药物多为手性杂环聚酮类分子，l-哌啶甲酸是其中核心的构件之一，也是此类化合物天然代谢合成、人工生产合成过程的不可替代的部分。例如，l-哌啶甲酸参与合成抗肿瘤药物vx710、苦马豆碱等，抗生素山卓霉素、万可霉素等，因此，其在医学及生理学等领域具有非常高的应用价值。对哌啶甲酸合成的研究除了可以增加哌啶甲酸产量、加强这些药物的生产，还有可能促进以哌啶甲酸为核心结构的一大类药物的作用机制研究，甚至促进分子结构类似化合物的新药的开发。

随着药物合成工业的不断发展，人们对这类关键小分子需求也在不断增加。在2001年以前，l-哌啶甲酸主要通过化学合成来生产。然而，使用化学法合成光学纯的手性有机物通常都不是一个容易解决的问题。化学法合成l-哌啶甲酸只能通过直接以l-赖氨酸等手性物质为反应物、引入手性基团等方法。化学合成法步骤繁杂，并且过程存在污染环境的问题。更加安全、绿色、经济的生物合成l-哌啶甲酸的方法开始受到业界的关注。利用生物法制备l-哌啶甲酸具有反应步骤较少，过程绿色环保等有优点，但生物法目前仍因产量相对较低、操作步骤繁杂等缺点，使其尚且不适用于大规模工业化生产l-哌啶甲酸。因此，需要开发一种新的方法以解决现有技术存在的问题。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中生物法催化生产l-哌啶甲酸过程中产量低、菌体耐受性低、产物分离困难、连续化生产步骤繁琐的问题，提供一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产l-哌啶甲酸的方法，该方法对于l-哌啶甲酸的产量有了明显的提升，并且显著简化了生物催化过程中的产物分离过程。

发明思路：如图1所示，利用海藻酸钠凝胶掺杂纳米金属-有机框架材料与大肠杆菌共混合制备出多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂，即构建多级孔道的凝胶微球对大肠杆菌进行包裹固定大肠杆菌后，利用表面活性剂或有机试剂对大肠杆菌细胞膜进行通透性修饰，提升大肠杆菌产l-哌啶甲酸的催化活性，其次掺杂了纳米金属-有机框架材料的凝胶微球，可以利用多级孔道结构对l-哌啶甲酸进行选择性富集，进而简化产物回收过程。本发明通过材料设计和大肠杆菌生物催化的过程研究，建立多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂，同时兼顾了l-哌啶甲酸的生产和分离。一，利用海藻酸钠凝胶掺杂纳米金属-有机框架材料，实现了对催化反应过程中l-哌啶甲酸的选择性富集；二，多孔道吸附凝胶结合大肠杆菌，提高了大肠杆菌的催化生产l-哌啶甲酸的产量；三，实现生物法连续化生产l-哌啶甲酸，减少操作步骤，对于提高l-哌啶甲酸的产量具有实际应用价值。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产l-哌啶甲酸的方法，包括如下步骤：(i)将具备细胞活性的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂按照0.08～0.16g/ml的用量接种于含氯霉素和卡那霉素的发酵培养基中培养，得到第一发酵液；(ii)向第一发酵液中加入阿拉伯糖培养，得到第二发酵液；(iii)向第二发酵液中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导表达发酵，得到第三发酵液；(iv)将第三发酵液进一步发酵，即得含有l-哌啶甲酸的的发酵液。

步骤(i)中，所述的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂的制备方法为：

(1)将硫酸钴类化合物和咪唑类化合物搅拌混合，离心，所得沉淀干燥，得到纳米金属有机框架；

(2)将步骤(1)得到的纳米金属有机框架通过水与海藻酸钠混合均匀，得到掺杂凝胶的纳米金属有机框架；

(3)将步骤(2)得到的掺杂凝胶的纳米金属有机框架与大肠杆菌溶液混合，搅拌，得到掺杂凝胶混合大肠杆菌的纳米金属有机框架；

(4)向步骤(3)得到的掺杂凝胶混合大肠杆菌的纳米金属有机框架中滴加金属离子溶液，静置，得到直径为1～3mm的多级孔道吸附凝胶耦合大肠杆菌的微球；

(5)将步骤(4)得到的微球加入培养基中培养，搅拌；再向其中加入甜菜碱，搅拌，取出微球，即得多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂。

步骤(1)中，所述的硫酸钴类化合物优选为coso4·6h2o；所述的咪唑为2-甲基咪唑、咪唑或其他咪唑衍生物；所述的溶液中，溶剂为甲醇，硫酸钴类化合物的浓度为0.1-0.8mmol/ml，优选为0.4mmol/ml，咪唑类化合物的浓度为0.5-2.5mmol/ml，优选为1.6mmol/ml；所述的搅拌混合为在室温下500rpm搅拌6-36h，优选为12h；所述的离心为6000rpm离心15min。

步骤(1)中，所述的纳米金属有机框架为zif-67、zif-8或者其衍生物的其中的一种或者多种。

步骤(2)中，纳米金属有机框架与海藻酸钠的质量比为1:10～1：30；纳米金属有机框架与水的质量体积比为0.05～0.25mg/ml；优选地，纳米金属有机框架与海藻酸钠的质量比为1:20；纳米金属有机框架与水的质量体积比为0.1mg/ml。

其中，所述的海藻酸钠的分子量为上海国药沪试的海藻酸钠。

步骤(2)中，所述的混合均匀为微波加热5～10s至海藻酸钠粉末完全溶解于水中，以500rpm转速搅拌15min至纳米金属有机框架粉末在海藻酸钠凝胶中混合均匀。

步骤(3)中，所述的大肠杆菌溶液od600为20；掺杂凝胶的纳米金属有机框架与大肠杆菌溶液的体积比为1:1～5:1，优选为5:1；所述的搅拌为300rpm，4℃搅拌30min。

步骤(4)中，所述的金属离子溶液为含有亚铁离子和钙离子的水溶液，亚铁离子的浓度为20～120mmol/l，优选为60mmol/l，钙离子的浓度为20～120mmol/l，优选为60mmol/l；金属离子溶液与掺杂凝胶混合大肠杆菌的纳米金属有机框架的体积比为100:1～100:25，优选为100:6；滴加速率为1～5滴/s；静置的时间为15～60min，优选为30min。

步骤(5)中，将步骤(4)得到的微球按照1g/100ml～10g/100ml，优选为8g/100ml培养基的比加入lb培养基中，于15～35℃下搅拌5～10min，优选为于20℃下搅拌5min，以激活大肠杆菌；再向其中加入100～600mg甜菜碱/8g微球，优选为500mg甜菜碱/8g微球，于15～35℃下搅拌15～60min，优选为于20℃下搅拌30min，取出微球，即得多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂。

步骤(i)中，所述的具备细胞活性的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂为将多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂置于lb培养基中，37℃，100～300rpm培养3h，以让细胞进行少量的繁殖或生长，保证不被表面活性剂损伤的过于严重。

步骤(i)中，所述的含氯霉素和卡那霉素的发酵培养基中氯霉素和卡那霉素的含量分别为10～40mg/l和20～60mg/l，优选地，两者的含量分别为34mg/l和50mg/l；具体成分为：葡萄糖30g/l、硫酸铵10g/l、硫酸亚铁0.3g/l，酵母粉2g/l、蛋白胨5g/l、氯化钾0.5g/l、七水硫酸镁1.6g/l、维生素b160mg/l；还含有：34mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素。所述的发酵培养基使用mopos缓冲液(100mm)，调整ph值调整至7。

步骤(i)中，所述的培养为37℃，200rpm培养2h。

步骤(ii)中，所述的阿拉伯糖的终浓度为0.5～2.5g/l，优选为1g/l；所述的培养为37℃，200rpm培养1h。

步骤(iii)中，所述的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷的终浓度为50～300mg/l，优选为100mg/l，25℃，200rpm诱导表达12h。

步骤(iv)中，所述的进一步发酵为将第三发酵液于37℃，200rpm发酵48h。

步骤(iv)中，从含有l-哌啶甲酸的的发酵液中取出多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂，按其照1g/100ml～10g/100ml培养基的比加入lb培养基中，于15～35℃下搅拌5～10min；再向其中加入100～600mg甜菜碱，于15～35℃下搅拌15～60min，取出微球，即得具备细胞活性的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂，再次重复使用；优选地，将其按照8g/100ml培养基的比加入lb培养基中，于20℃下搅拌5min；再向其中加入500mg甜菜碱，于20℃下搅拌30min。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1.以较低的材料成本、操作简便的合成方法、简化生产操作步骤的策略得到了一种利用固定化全细胞催化生产l-哌啶甲酸的体系。

2.通过构建固定化全细胞凝胶微球的方法，提高了细胞的在催化过程中的催化活性。

3.利用金属-有机框架材料与凝胶微球的组合，兼多种孔道尺寸与结构的优点，有效提升了对于l-哌啶甲酸的吸附效果。

4.这种组合，可设计性强，可以按照需求进行孔道尺寸的组合与特异性吸附改造，并且生物相容性好，维持了较好的微生物耐受性以及重复利用性。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂的示意图。

具体实施方式

实施例1菌株的构建和培育过程

1.1菌株的构建

以e.colibl21(de3)为宿主菌，将含有分子伴侣基因的pgro7质粒和含赖氨酸环化脱氨酶splcd的质粒(pet28a-val61-val94-splcd)转化e.colibl21(de3)，即得到e.colilpa2菌株，参考专利cn201811365167.2：一种混合菌发酵生产l-哌啶甲酸的方法中的实施例8。

1.2培养基

平板培养基(l^-1)：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，琼脂20g，卡那霉素0.05g。

lb培养基(l^-1)：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，卡那霉素0.05g。

灭菌方法：对抗生素进行过滤除菌，其余进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121℃，20min。

1.3平板培养

将储存于-80℃冰箱内的菌株取出，在平板培养基上进行划线操作，然后将平板放于37℃恒温培养箱内，培养8-12h。

1.4细胞培养

平板挑点，加入5ml的lb培养基制备得到种子液，37℃过夜培养12h。将5ml种子液接入100mllb培养基后，37℃、200rpm培养2h，使其生长至od600约为0.4时，加入l-阿拉伯糖溶液使培养液中l-阿拉伯糖浓度为1g/l(分子伴侣为pg-tf2时以终浓度为1mg/l的四环素代替1g/l的l-阿拉伯糖)，诱导合成分子伴侣。再于37℃、200rpm培养1h，使其生长至od600约为0.6时，加入培养液0.1％(v/v)的0.5mol·l^-1的iptg溶液。置于诱导温度诱导产酶12h。测量此时培养液od600，随后于6000rpm离心15min，除去上清，加入磷酸缓冲液重悬清洗，并再次于6000rpm离心15min。加入磷酸缓冲液重悬使得od600为20。

实施例2多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂的合成

2.1纳米金属有机框架的合成

10mmol的coso4·6h2o和40mmol2-甲基咪唑分别溶解在25ml甲醇中，室温下混合以500rpm转速，室温搅拌12h，随后于6000rpm离心15min，并用清水洗涤沉淀，离心洗涤过程持续三次后，置于冻干机中除去水分得到zif-67粉末。

2.2纳米金属有机框架掺杂凝胶

将10mg的zif-67粉末与200mg的海藻酸钠粉末混合，并加入100ml的去离子水，微波加热5～10s至海藻酸钠粉末完全溶解，以500rpm转速搅拌15min至zif-67粉末在海藻酸钠凝胶中混合均匀。

2.3纳米金属有机框架掺杂凝胶混合细胞

将5ml2.2制备所得混合含有zif-67粉末在海藻酸钠凝胶与1mlod600＝20的实施例1制备得到的大肠杆菌溶液混合，在300rpm转速下保持4℃搅拌30min，得到zif-67掺杂凝胶混合大肠杆菌。

2.4多级孔道吸附凝胶耦合大肠杆菌微球

利用注射器抽取2.3中的6mlzif-67掺杂凝胶混合大肠杆菌，通过注射器锐孔按照约1滴/s的速率滴加入100ml金属离子水溶液(含60mmol/l的亚铁离子、60mmol/l的钙离子)中静置30min后，即得到约为2mm直径的多级孔道吸附凝胶耦合大肠杆菌微球。

2.5多级孔道吸附凝胶耦合大肠杆菌微球的后处理

取出2.4中湿重约8g多级孔道吸附凝胶耦合大肠杆菌微球加入100ml的lb培养基中，以200rpm转速下20℃搅拌5min进行激活大肠杆菌后，加入500mg的甜菜碱对微球内的大肠杆菌进行细胞膜通透性处理，以200rpm转速下20℃搅拌30min后，取出微球即得到多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂。

实施例3检测方法l-哌啶甲酸的方法

(1)氨基酸衍生化

为了更加精准的测定样品中的氨基酸含量，将样品在液相层析之前进行氨基酸衍生化。本发明使用异硫氰酸苯酯(pitc)衍生法：(1)配制14vt％三乙胺-乙腈溶液和1.25vt％pitc-乙腈溶液。(2)取样品400μl，再加入200μl配制好的14vt％三乙胺-乙腈溶液，再加入200μl1.25vt％pitc-乙腈溶液，混匀，静置1h。(3)加入己烷800μl，充分震荡后静置10min。(4)混合液分层后取下层溶液，用0.22μm滤膜过滤，将滤液用于后续分析。

(2)高效液相色谱层析(hplc)分析

色谱柱为gracealltimac185u(250mm×4.6mm)；检测器为uv检测器，检测波长254nm。运行时柱温设定为40℃，流速1ml/min，进样量5μl。流动相a为0.1mol/l醋酸钠水溶液与乙腈混合液，比例为93:7(v/v)；流动相b为80vt％乙腈，20vt％水；

流动相比例梯度如表1：

表1

实施例4多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂催化活性及l-哌啶甲酸回收性能

(1)将实施例2.5中制备的多级孔道吸附凝胶耦合生物8g催化剂置于50mllb培养基中培养条件下培养3h；(2)将步骤(1)处理后的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂全部(包括凝胶颗粒物和培养液)接种于500ml含34mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(3)向步骤(2)得到的发酵液中加入l-阿拉伯糖使发酵液中l-阿拉伯糖浓度为1g/l，将发酵液置于培养条件下培养1h；(4)向步骤(3)得到的发酵液中加入iptg使发酵液中iptg浓度为100mg/l，将发酵液于诱导条件下诱导表达12h；(5)将步骤(4)得到的发酵液置于发酵条件下发酵48h。

所述的发酵培养基主要成分包含葡萄糖30g/l、硫酸铵10g/l、硫酸亚铁0.3g/l，酵母粉2g/l、蛋白胨5g/l、氯化钾0.5g/l、七水硫酸镁1.6g/l、维生素b160mg/l；还含有：34mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素。所述的发酵培养基使用mopos缓冲液(100mm)，调整ph值调整至7。

所述的诱导条件为25℃，200rpm；发酵条件为37℃，200rpm；培养条件为37℃，200rpm。

将步骤(5)发酵48h后的发酵液经hplc分析检测，l-哌啶甲酸产量为627.2mg/l；其中，对步骤(5)所得发酵液进一步6000rpm离心10min，所得上清液中l-哌啶甲酸占比为0.3％，离心后的固体沉淀物：多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂经过酸水解后释放的l-哌啶甲酸占比为99.7％。

其中，所述的酸水解为将固体沉淀物全部加入到100mlph2.2100mmol/l的柠檬酸钠缓冲液中进行酸解，4小时，搅拌速率为600rpm，室温。

实施例5多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂连续催化性能

(1)将实施例2.5中制备的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂8g置于50mllb培养基中培养条件下培养3h；(2)将将步骤(1)处理后的多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂全部接种于500ml含34mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(3)向步骤(2)得到的发酵液中加入l-阿拉伯糖使发酵液中l-阿拉伯糖浓度为1g/l，将发酵液置于培养条件下培养1h；(4)向步骤(3)得到的发酵液中加入iptg使发酵液中iptg浓度为100mg/l，将发酵液置于诱导条件下诱导表达12h；(5)将步骤(4)得到的将发酵液置于发酵条件下发酵48h。(6)取出多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂置于8g多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂/100ml的lb培养基中，以200rpm转速下20℃搅拌5min进行菌株激活后，加入500mg的甜菜碱对微球内的大肠杆菌再次进行细胞膜通透性处理，以200rpm转速下20℃搅拌30min后取出。(7)将多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂接种于500ml含34mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(8)向步骤(7)得到的发酵液中加入l-阿拉伯糖使发酵液中l-阿拉伯糖浓度为1g/l，将发酵液置于培养条件下培养1h；(9)向步骤(8)得到的发酵液中加入iptg使发酵液中iptg浓度为100mg/l，将发酵液置于诱导条件下诱导表达12h；(10)向步骤(9)得到的发酵液中将发酵液置于发酵条件下再次发酵48h。

所述的发酵培养基主要成分包含葡萄糖30g/l、硫酸铵10g/l、硫酸亚铁0.3g/l，酵母粉2g/l、蛋白胨5g/l、氯化钾0.5g/l、七水硫酸镁1.6g/l、维生素b160mg/l；还含有：34mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素。所述的发酵培养基使用mopos缓冲液(100mm)，调整ph值调整至7。

所述的诱导条件为25℃，200rpm；发酵条件为37℃，200rpm；培养条件为37℃，200rpm。

将步骤(10)发酵48h后的发酵液经hplc分析检测，l-哌啶甲酸产量为935.4mg/l；其中上清液中l-哌啶甲酸占比为1.7％，离心后的固体沉淀物：多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂经过酸水解后释放的l-哌啶甲酸占比为98.3％。

其中，所述的酸水解为将固体沉淀物全部加入到100mlph2.2100mmol/l的柠檬酸钠缓冲液中进行酸解，4小时，搅拌速率为600rpm，室温。

对比例1传统细胞发酵催化活性

(1)将实施例1构建的e.colilpa2接种于5mllb培养基中置于培养条件下培养12h，获得细胞od600＝1作为e.colilpa2的一级种子液；(2)将一级种子液5ml接种于500ml含34mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素的发酵培养基中，将接种后的发酵液置于培养条件下培养2h；(3)向步骤(2)得到的发酵液中加入l-阿拉伯糖使发酵液中l-阿拉伯糖浓度为1g/l，将发酵液置于培养条件下培养1h；(4)向步骤(3)得到的发酵液中加入iptg使发酵液中iptg浓度为100mg/l，将发酵液置于诱导条件下诱导表达12h；(5)将步骤(4)得到的发酵液置于发酵条件下发酵48h。

所述的发酵培养基主要成分包含葡萄糖30g/l、硫酸铵10g/l、硫酸亚铁0.3g/l，酵母粉2g/l、蛋白胨5g/l、氯化钾0.5g/l、七水硫酸镁1.6g/l、维生素b160mg/l；还含有：34mg/l的氯霉素和50mg/l的卡那霉素。所述的发酵培养基使用mopos缓冲液(100mm)，调整ph值调整至7。

所述的诱导条件为25℃，200rpm；发酵条件为37℃，200rpm；培养条件为37℃，200rpm。

将步骤(5)发酵48h后的发酵液经hplc分析检测，l-哌啶甲酸产量为210.3mg/l

综上所述，本发明种多级孔道吸附凝胶耦合生物催化剂生产l-哌啶甲酸的方法，基于利用凝胶网络结构增强了微生物在催化过程中的使用效能，其次利用金属有机框架的高比表面积结合凝胶网络构建的多级孔道结构对产物进行有效的吸附，简化了产物的分离过程。其具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。