一种提取食用菌高质量DNA原始样品的筛选方法与流程

本发明涉及食用菌dna提取技术，具体涉及一种提取食用菌高质量dna原始样品的筛选方法。
背景技术：
：随着食用菌产业的快速发展，人们对食用菌品种之间的亲缘关系的分析，菌株的分子鉴定，菌种的基因测序和菌种的蛋白组基因测序等都离不开高质量高纯度的dna的提取；用于食用菌dna提取的样品有三种：第一种是培养皿pda培养的菌丝体，第二种是用液体培养基培养的菌丝球，第三种是子实体。第一种菌丝体因培养和取样都不方便，一般使用极少；经常使用的样品是菌丝球和子实体。对食用菌dna提取的最大干扰是食用菌里面的多糖，多糖越多，对高纯度高质量的dna提取的干扰因素就越大，进而影响基因测序和品种鉴定及聚类分析的精准度；不同的食用菌品种一般都有不同含量的多糖，而且在各个生长阶段的同一种食用菌样品的多糖含量都有显著差异；一般的优化提取方法是最大限度的去除提取dna过程中的多糖，但是去除多糖的过程中会破坏掉dna结构的完整性。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种可从源头上减少多糖对后续提取dna的干扰的提取食用菌高质量dna原始样品的筛选方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种提取食用菌高质量dna原始样品的筛选方法，包括以下步骤：（1）筛选初选样品：选取食用菌的菌丝体样品与子实体样品，分别进行总糖与多糖含量的检测，并进行含量的对比，选择多糖含量最低的样品为初选样品；（2）筛选第二次筛选样品：步骤（1）筛选得到的初选样品如果是菌丝体样品，直接用于dna提取；筛选得到的初选样品如果是子实体样品，则对不同生长阶段的子实体进行取样，分别进行总糖与多糖含量的检测，并进行含量的对比，选择多糖含量最低的样品为第二次筛选样品；（3）筛选第三次筛选样品：根据步骤（2）筛选得到的第二次筛选样品所属的生长阶段，对该生长阶段的子实体的不同部位进行取样，分别进行总糖与多糖含量的检测，并进行含量的对比，选择多糖含量最低的样品作为第三次筛选样品；（4）检验第三次筛选样品：对第三次筛选样品进行dna提取，并进行its鉴定，查看dna条带的清晰度和完整度，是否得出准确的遗传序列，以及是否达到预期效果。进一步，所述总糖与多糖含量的检测包括还原糖提取及含量测定、总糖含量测定和多糖含量的计算。进一步，所述还原糖提取及含量测定包括：称取食用菌相应的样品，洗净切碎后磨成浆液，然后将浆液压滤，得到滤渣；将滤渣烘干后研细，然后过筛得到筛下物为待测样品；将待测样品置于烘箱中烘干至恒重，然后依次进行粉碎和过筛；将得到的粉末包于滤纸包内，浸于烧杯中用沸水浸煮，然后多次提取获得提取液，再混合多次提取的提取液并浓缩得到浓缩液，往浓缩液中添加无水乙醇，并搅拌均匀，静置一段时间后，离心并取上清液，之后用蒽酮硫酸比色法检测上清液的还原糖含量。进一步，所述总糖含量测定包括：用蒽酮硫酸比色法检测还原糖提取过程的所述提取液的总糖含量；所述多糖含量的计算为：总糖含量减去还原糖含量即为多糖含量。进一步，所述滤渣烘干温度为80℃～85℃，所述待测样品的烘干温度为50～70℃（优选55～65℃，更优选60℃），所述过筛选用80～120目筛网（优选90～110目，更优选100目）筛网，所述滤纸为3～5层纱布（优选4层纱布），所述浓缩液与无水乙醇的体积比为1:4，所述还原糖含量和总糖含量的检测均重复2～4次（优选3次），然后取平均值。进一步，步骤（4）中，所述dna提取采用改良ctab法。进一步，所述改良ctab法，包括以下步骤：1）称取第三次筛选样品于液氨中研磨成粉末，然后将该粉末置入离心管中，再加入64～66℃(优选65℃)预热的ctab提取缓冲液，然后混匀，之后将离心管进行64～66℃（优选65℃）水浴，并振荡；2）离心管进行离心后取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇溶液和无水乙醇；3）重复步骤2）；4）离心管进行离心后取上清液，加入乙酸钠溶液，然后加入与上清液等体积的异丙醇，充分混匀后冷冻沉淀；之后再次离心，得到dna沉淀；然后用乙醇反复洗涤dna沉淀，直至dna沉淀显透明状，然后通风使乙醇挥发干净，直至dna沉淀试管无乙醇味且dna沉淀的表面保持湿润；5）往dna沉淀试管中依次超纯水溶解dna和rna消化酶，之后将dna沉淀试管进行37℃水浴消化；6）以dna为模板，采用真菌通用引物its1和its4扩增其its序列。进一步，所述水浴时间为50～70min（优选55～65min，更优选60min），所述振荡频率为每隔8～12min（优选9～11min，更优选10min）一次，所述离心的转速为10000～14000r/min（优选12000r/min），时间为8～12min（优选9～11min，更优选10min）。进一步的，所述无水乙醇为氯仿异戊醇溶液体积的25～35%（优选28～32%，更优选30%），所述氯仿异戊醇溶液中氯仿与异戊醇的体积比为20～28:1（优选22～26:1，更优选24:1），所述乙酸钠溶液为2～4mol/l（优选2.5～3.5，更优选3mol/l）。进一步的，所述异丙醇的温度为-15～-25℃（优选-18～-22℃，更优选-20℃），所述冷冻温度为-15～-25℃（优选-18～-22℃，更优选-20℃）。选择这些参数的理由，前期就是便于准确测量不同样本总糖和还原糖的量，后期提取dna的参数是为了在提取纯净dna的过程中，消除不相关杂质及多糖的干扰。本发明依次通过对食用菌的菌丝体样品与子实体样品，和各生长阶段的子实体样品，以及子实体不同部位的样品进行的三次筛选，分别进行总糖与多糖含量的检测，并进行含量的对比，逐步选择多糖含量最低的样品，并对第三次筛选样本进行its鉴定，查看dna条带的清晰度和完整度，能否得出准确的遗传序列，以及是否达到预期效果；从而解决了食用菌dna提取过程中，由于食用菌取样的随意性和高的多糖含量，出现dna提取纯度不高，量不大的问题。经实验验证，通过本发明筛选的原始样本提取dna，再采用its法跑条带，其条带清晰度好，没有明显的拖尾等现象，证明其提取的dna质量非常好，减少后续数据统计的误差，极大地提高基因测定、遗传关系远近聚类分析、菌种鉴定和蛋白组学分析的工作效率。附图说明图1是本发明实施例的食用菌菌丝体样品与子实体样品的总糖与多糖含量对比图；图2是本发明实施例的不同生长阶段的食用菌子实体对比图；图3是本发明实施例的食用菌子实体的不同部位样品的总糖与多糖含量对比图；图4是本发明实施例的ⅰ期食用菌子实体的菌柄中下部位的its条带图。具体实施方式下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明：如图1所示，本发明提取食用菌高质量dna原始样品的筛选方法的实施例，包括以下步骤：（1）筛选初选样品：选取食用菌的菌丝体样品与子实体样品，分别进行总糖与多糖含量的检测，并进行含量的对比，选择多糖含量最低的样品为初选样品；总糖与多糖含量的检测包括还原糖提取及含量测定、总糖含量测定和多糖含量的计算；还原糖提取及含量测定包括：称取食用菌相应的样品，洗净切碎后用多功能食品加工机磨成浆液，然后将浆液用4层纱布压滤，得到滤渣；将滤渣放入烘箱内82℃烘干后，再用植物粉碎机研细，然后用100目筛过筛，所得筛下物为待测样品；将待测样品置于60℃烘箱中烘干至恒重，然后依次进行粉碎和过筛；将得到的粉末包于滤纸包内，浸于烧杯中用沸水浸煮，然后多次提取获得提取液，再混合多次提取的提取液并浓缩得到浓缩液，往浓缩液中添加4倍量的无水乙醇，并搅拌均匀，静置一段时间后，离心并取上清液，之后用蒽酮硫酸比色法检测上清液的还原糖含量，重复3次，取平均值；总糖含量测定包括：用蒽酮硫酸比色法检测还原糖提取过程的所述提取液的总糖含量；糖含量的计算为：总糖含量减去还原糖含量即为多糖含量。（2）筛选第二次筛选样品：如图1所示，上一步骤中筛选得到的初选样品是子实体样品，则对不同生长阶段的子实体进行取样，如图2所示，分别进行总糖与多糖含量的检测，并进行含量的对比，如表1所示，选择多糖含量最低的样品为第二次筛选样品；表1不同生长时期杏鲍菇子实体总糖含量吸光度ⅰ期ⅱ期ⅲ期ⅳ期ⅴ期a10.2160.2120.2310.2290.263a20.1720.1880.2270.2310.286a30.1740.1910.2220.2350.285a`x0.1870.1870.2270.2320.278总糖含量32.20%33.36%36.92%37.52%43.09%（3）筛选第三次筛选样品：根据上一步骤中筛选得到的第二次筛选样品所属的生长阶段，对该生长阶段的子实体的不同部位进行取样，分别进行总糖与多糖含量的检测，并进行含量的对比，选择多糖含量最低的样品为第三次筛选样品，如图3所示。（4）检验第三次筛选样品：根据以上测量采取杏鲍菇子实体ⅰ期的，菌柄中下部位为原始样本进行提取dna并做its检测，其跑的条带清晰，质量高，具体如图4所示；dna提取采用改良ctab法，具体步骤如下：1）、称取第三次筛选样品于液氨中研磨成粉末，然后将该粉末置入离心管中，再加入65℃预热的ctab提取缓冲液，然后混匀，之后将离心管进行65℃水浴，并振荡；2）、离心管进行离心后取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇溶液和无水乙醇；3）、重复步骤2）；4）、离心管进行离心后取上清液，加入乙酸钠溶液，然后加入与上清液等体积的异丙醇，充分混匀后冷冻沉淀；之后再次离心，得到dna沉淀；然后用乙醇反复洗涤dna沉淀，直至dna沉淀显透明状，然后通风使乙醇挥发干净，直至dna沉淀试管无乙醇味且dna沉淀的表面保持湿润；5）、往dna沉淀试管中依次超纯水溶解dna和rna消化酶，之后将dna沉淀试管进行37℃水浴消化；6）、以dna为模板，采用真菌通用引物its1和its4扩增其its序列。a.称取0.8gⅰ期的杏鲍菇子实体中下部放入预冷的研钵中，然后加入适量的液氮并迅速研磨成粉末；b.称取0.5g杏鲍菇子实体粉末放入离心管中，加入65℃预热的ctab(100mmol/ltris-hcl(ph8.0),20mmol/ledta(ph8.0),1.4mol/lnacl,3%ctab,2%pvp,2.67%β-巯基乙醇)4ml，然后上下轻微振荡离心管，使提取液与子实体粉末混合均匀，再放入提前预热到65℃的水浴锅中水浴1h，每隔10min来回轻微振荡一次，使裂解过程在均匀的环境下进行；c.离心管在12000r/min转速下离心10min；然后取上清液，依次加入4mltris-酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和1.2ml约30%无水乙醇，再次离心，转速和离心时间同上；d.离心后取用上清液移到空试管中，再依次加入4ml氯仿:异戊醇(24:1)和1.2ml约30%无水乙醇，来回振荡振荡混匀，再次离心，转速同上，离心10min；e.离心后取上清液并转移到空试管中，再加入400μl乙酸钠（3mol/l,ph5.2），最后加入与提取液等体积的且-20℃预冷1h的异丙醇，充分混匀，然后放置于-20℃的冰箱中过夜使dna沉淀；f.之后把过冷冻过夜后的dna沉淀试管取出，不要震荡放入高速离心机中，转速及离心时间同上，弃上清液后，得到dna沉淀；对dna沉淀用75%乙醇反复洗涤2-3次，把里面的杂质洗脱干净直到dna看起来较透明，在室温下的通风橱内快速挥干乙醇，直至dna沉淀试管内无乙醇味，但dna表面仍保持湿润为佳；g.往dna沉淀试管中加入100μl超纯水溶解dna；h.最后加入1.2μl50mg/mlrna消化酶，然后放入37℃水浴锅中消化1h；i.以dna为模板，采用真菌通用引物its1（5-tccgtaggtgaacctgcgg-3）和its4（5-tcctccgcttattgatatgc-3）扩增其its序列。验证最终找出食用菌在提取高质量dna的原始样本中，食用菌总糖含量最低的生长阶段和部位，并通过在进行做its菌种鉴定的过程中，通过选取多糖含量最低的食用菌ⅰ期的幼菇的中下部位做原始样本，最终达到提取的dna，跑出的条带十分清晰和完整，从侧面验证了用此样品提取的dna质量非常高，达到了预期效果。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应当视为在本发明的保护范围之内。说明书中未详细说明的内容属于本领域技术人员熟知的现有技术。当前第1页12