专利名称:鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法
技术领域：
本发明涉及一种鸟氨酸盐酸盐制备方法，尤其是指一种鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合 制备方法。
背景技术：
鸟氨酸(Ornithine)，是一种氨基酸，是在精氨酸(Arginine)产生尿素(尿的构 成)时的新陈代谢产生的，是重要的医药中间体及原料药和食品添加剂，主要用于治疗肝 硬化，疾病的恢复以及增强体能。
国内公开号为CN1590367的一种L-鸟氨酸盐酸盐的制备方法，其主要内容包括 L-精氨酸溶于水中，加入相转移催化剂冠醚和石灰乳氢氧化钙，在搅拌回流加热后加入助 催化剂胆碱，然后待反应混合物冷却后以6N硫酸调PH值。再经过滤去除硫酸钙，其滤液经 减压浓缩后用饱和氢氧化钡溶液调PH值，再经过滤去除硫酸钡沉淀，其滤液以3N盐酸调 PH，再经真空浓缩后加入乙醇，待冷却后滤出。此方法的产品收率可达78 82%，纯度为 彡 99. 0%，比旋光度[A]d2°+23. 0 +24. 50。
目前大多数的生产方法过多依赖化学试剂，对环境破坏大，成本高，产品收率以及 纯度得不到保证。
发明内容
本发明提供一种经济环保的鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法。充分利用生物酶 制得产品，区别现在大多数过多依赖化学试剂的生产方法。
本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的
鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法的步骤包括
A、将精氨酸干品作为底物溶于去离子水中配成转化液，用2N盐酸调节PH至7 10之间，升温至38°C 45°C，加入从新鲜牛肝中提取的牛肝酶液，加入触媒，放入38°C 45°C恒温水域摇床中转化10 40小时；
B、将步骤A得到的溶液取样，点板，待精氨酸斑点转化完全消失后，加入5 20ml/ L的新鲜黄豆中提取的脲酶，30°C 35°C保温反应40 70分钟后，滴加6N盐酸酸化至 PH5 6之间，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出后，向浓缩液中加入其2 5倍体积的酒 精，60°C 90°C条件下回流Ih后，冷却结晶，离心过滤后得鸟氨酸盐酸盐粗品；
C、将步骤B得到的鸟氨酸盐酸盐粗品溶解于去离子水中，升温至70°C 80°C，加 入粗品重量3 10%的活性炭，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出后，向浓缩液中加入其 2 5倍体积的酒精，冷却结晶，离心过滤去母液后用少量乙醇清洗晶体表面残留母液，干 燥后得成品。
上述鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，作为优选，所述的步骤A中，溶液中加入
牛肝酶液的量是以每IL转化液中，加入20ml 120ml的牛肝酶液。
根据本方法转化效率及后序提取、精制加工等工艺的要求，有效的控制酶在转化液中的浓度，不仅可以提高转化效率，亦可充分利用酶活力，使反应体系达到一个最佳的平 衡环境，确保产品的后序提取，精制加工的要求。
上述鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，作为优选，所述的步骤A中，转化液底物 浓度控制在50 300g/L。底物浓度的控制决定反应底物向目标产物的转化效率，及符合后 序加工工艺的要求，因此有效的控制反应底物的浓度，不仅可以提高反应转化效率，易可充 分的利用酶活力，使反应环境符合反应动力学的要求，从而达到稳定工艺，提高生产效率， 节约能源的目的。
上述鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，作为优选，所述的步骤A中，触媒为Mn2+ 离子，Mn2+离子浓度控制在0. 2 0. 6mmol/L0 Mn2+触媒可以是硫酸锰、醋酸锰、氯化锰等。
Mn2+的在反应体系中的浓度决定酶活的释放，及反应向产物方向的转移，浓度过 低、过高都会抑制酶活，促使反应时间的延长。
上述鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，作为优选，所述的步骤B中，点板展开剂 为正丙醇和氨水，其质量百分比为正丙醇氨水=65 75 35 25。上述溶液的质量百 分比为有效成分的质量百分比。
展开剂的选择及配比决定对成分的溶解及组分之间的分离效果，且不与组分间发 生反应，本展开剂的组分选择及配比可使产物与底物其他相关杂质有效的分离，呈现清晰 的独立斑点。
最为优选，所述的正丙醇和氨水的质量百分比为正丙醇氨水=72 28。
上述鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，作为优选，所述的步骤C中，鸟氨酸盐酸 盐粗品按重量比10% 30%的浓度溶解于去离子水中。
此步骤为精制过程，生产过程中，一次性产品出来很难直接达到合格，因此需要一 个精制过程。
上述鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，作为优选，所述的步骤A中，牛肝酶液的 制备方法为取新鲜牛肝于冰冻粉碎机内进行粉碎、细胞破壁，然后在4°C保存待用，将牛 肝浆溶解于1 4倍质量比的去离子水中，加入Mn2+离子，且浓度控制在0. 2 0. 6mmol/ L,共热至30 70°C之间，保温0. 5 2小时，过滤、收集滤液，滤液经高速离心后，立即存放 于4°C冰箱中待用。Mn2+触媒可以是硫酸锰、醋酸锰、氯化锰等。
上述鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，作为优选，所述的步骤B中脲酶的制 备方法为将新鲜黄豆粉碎后，与30%体积百分比的乙醇混合，黄豆与乙醇质量百分比为 1 2 3，然后在0 10°C下震荡10分钟，高速离心后取上清液，30 35°C使用，保温 40 70分钟。
本发明有以下优点
本发明方法的收率可达80-85%，产品纯度可达99%以上。
本发明所采用的酶均来自于廉价易得的资源，动物酶从市售牛肝中提取，植物酶 来自于黄豆的萃取液。
本发明方法与化学法相比具有工艺控制稳定，反应步骤少，生产效率高，成本低等 优点。
本发明方法与发酵法相比，采用酶技术制备鸟氨酸盐酸盐产品，克服了发酵法菌 种保藏及发酵过程控制染菌的难题，且发酵法环境污染大，生产污水量大，由于菌种发酵每升发酵液的产量极低，工艺不稳定等问题成为了发酵法制备该产品的难题。
本发明特点在于工艺控制稳定，反应步骤少，生产成本低，环境污染小，能耗低，所 得产品纯度高等优点，具有产业化的前景。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
实施例1
精氨酸酶的制备
取新鲜牛肝100g，于冰冻粉碎机内进行粉碎，细胞破壁，然后在4°C保存待用，取 IOOg牛肝浆溶解于400ml去离子水中，加入催化剂，催化剂为硫酸锰，有效催化成分为Mn2+ 离子，且浓度控制在0. 2mmol/L，共热至30°C，保温0. 5小时，过滤、收集滤液，滤液经高速离 心后，立即存放于4°C冰箱中待用。
脲酶的制备
取新鲜黄豆100g，粉碎后，与30%体积百分比的乙醇混合，黄豆与乙醇质量百分 比为1 3，然后在10°C下震荡10分钟，高速离心后取上清液，30°C使用，保温40分钟，保 存在4°C以下。
转化反应
将IOOg精氨酸干品溶于2000ml去离子水中，用2N盐酸调节PH至10，升温至 45°C，加入120ml从新鲜牛肝中提取的牛肝酶液，加入触媒，触媒为醋酸锰，有效催化成分 为Mn2+离子，Mn2+离子浓度控制在0. 6mmol/L，放入45°C恒温水域摇床中转化40小时；
将上述溶液取样，点板，点板展开剂为正丙醇和氨水，正丙醇和氨水质量百分比为 正丙醇氨水=65 35，待精氨酸斑点转化完全消失后，加入5ml/L的新鲜黄豆中提取的 脲酶，30°C保温反应40分钟后，滴加6N盐酸酸化至PH5，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出 后，向浓缩液中加入其2倍体积的酒精，60°C条件下回流Ih后，冷却结晶，离心过滤后得鸟 氨酸盐酸盐粗品；
将得到的鸟氨酸盐酸盐粗品取IOOg按重量比10%的浓度溶解于去离子水中，升 温至70°C，加入粗品重量3%的活性炭，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出后，向浓缩液中 加入其2倍体积的酒精，冷却结晶，离心过滤去母液后用少量乙醇清洗晶体表面残留母液， 干燥后得成品。
实施例2
精氨酸酶的制备
取新鲜牛肝100g，于冰冻粉碎机内进行粉碎，细胞破壁，然后在4°C保存待用，取 IOOg牛肝浆溶解于100ml去离子水中，加入催化剂，催化剂为醋酸锰，有效催化成分为Mn2+ 离子，且浓度控制在0. 6mmol/L,共热至70°C，保温2小时，过滤、收集滤液，滤液经高速离心 后，立即存放于4°C冰箱中待用。
脲酶的制备
取新鲜黄豆100g，粉碎后，与30%体积百分比的乙醇混合，黄豆与乙醇质量百分 比为1 2，然后在0°C下震荡10分钟，高速离心后取上清液，35°C使用，保温70分钟，保存 在4°C以下。[0044]转化反应
将IOOg精氨酸干品溶于300ml去离子水中，用2N盐酸调节PH至7，升温至38°C， 加入20ml从新鲜牛肝中提取的牛肝酶液，加入触媒，触媒为氯化锰，有效催化成分为Mn2+离 子，Mn2+离子浓度控制在0. 2mmol/L，放入38°C恒温水域摇床中转化10小时；
将上述溶液取样，点板，点板展开剂为正丙醇和氨水，正丙醇和氨水质量百分比为 正丙醇氨水=75 25，待精氨酸斑点转化完全消失后，加入20ml/L的新鲜黄豆中提取的 脲酶，35°C保温反应70分钟后，滴加6N盐酸酸化至PH6，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出 后，向浓缩液中加入其5倍体积的酒精，90°C条件下回流Ih后，冷却结晶，离心过滤后得鸟 氨酸盐酸盐粗品；
将得到的鸟氨酸盐酸盐粗品取IOOg按重量比30%的浓度溶解于去离子水中，升 温至80°C，加入粗品重量4%的活性炭，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出后，向浓缩液中 加入其5倍体积的酒精，冷却结晶，离心过滤去母液后用少量乙醇清洗晶体表面残留母液， 干燥后得成品。
实施例3
精氨酸酶的制备
取新鲜牛肝100g，于冰冻粉碎机内进行粉碎，细胞破壁，然后在4°C保存待用，取 IOOg牛肝浆溶解于200ml去离子水中，加入催化剂，催化剂为氯化锰，有效催化成分为Mn2+ 离子，且浓度控制在0. 4mmol/L，共热至35°C，保温1小时，过滤、收集滤液，滤液经高速离心 后，立即存放于4°C冰箱中待用。
脲酶的制备
取新鲜黄豆100g，粉碎后，与30%体积百分比的乙醇混合，黄豆与乙醇质量百分 比为1 2.9，然后在2°C下震荡10分钟，高速离心后取上清液，35°C使用，保温60分钟，保 存在4°C以下。
转化反应
将IOOg精氨酸干品溶于1800ml去离子水中，用2N盐酸调节PH至8，升温至44°C， 加入70ml从新鲜牛肝中提取的牛肝酶液，加入触媒，触媒为硫酸锰，有效催化成分为Mn2+离 子，Mn2+离子浓度控制在0. 25mmol/L，放入43°C恒温水域摇床中转化35小时；
将上述溶液取样，点板，点板展开剂为正丙醇和氨水，正丙醇和氨水质量百分比为 正丙醇氨水=68 32，待精氨酸斑点转化完全消失后，加入18ml/L的新鲜黄豆中提取的 脲酶，31°C保温反应45分钟后，滴加6N盐酸酸化至PH6，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出 后，向浓缩液中加入其4. 5倍体积的酒精，65°C条件下回流Ih后，冷却结晶，离心过滤后得 鸟氨酸盐酸盐粗品；
将得到的鸟氨酸盐酸盐粗品取IOOg按重量比15%的浓度溶解于去离子水中，升 温至77°C，加入粗品重量10%的活性炭，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出后，向浓缩液中 加入其2倍体积的酒精，冷却结晶，离心过滤去母液后用少量乙醇清洗晶体表面残留母液， 干燥后得成品。
实施例4
精氨酸酶的制备
取新鲜牛肝100g，于冰冻粉碎机内进行粉碎，细胞破壁，然后在4°C保存待用，取IOOg牛肝浆溶解于300ml去离子水中，加入催化剂，催化剂为硫酸锰和醋酸锰和氯化锰，有 效催化成分为Mn2+离子，且浓度控制在0. 5mmol/L，共热至50°C，保温1. 5小时，过滤、收集 滤液，滤液经高速离心后，立即存放于4°C冰箱中待用。
脲酶的制备
取新鲜黄豆100g，粉碎后，与30%体积百分比的乙醇混合，黄豆与乙醇质量百分 比为1 2，然后在8°C下震荡10分钟，高速离心后取上清液，32°C使用，保温45分钟，保存 在4°C以下。
转化反应
将IOOg精氨酸干品溶于1500ml去离子水中，用2N盐酸调节PH至7，升温至39°C， 加入35ml从新鲜牛肝中提取的牛肝酶液，加入触媒，触媒为硫酸锰和醋酸锰和氯化锰，有 效催化成分为Mn2+离子，Mn2+离子浓度控制在0. 2mmol/L，放入44°C恒温水域摇床中转化15 小时；
将上述溶液取样，点板，点板展开剂为正丙醇和氨水，正丙醇和氨水质量百分比为 正丙醇氨水=70 30，待精氨酸斑点转化完全消失后，加入18ml/L的新鲜黄豆中提取的 脲酶，31°C保温反应65分钟后，滴加6N盐酸酸化至PH5，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出 后，向浓缩液中加入其2 5倍体积的酒精，85°C条件下回流Ih后，冷却结晶，离心过滤后 得鸟氨酸盐酸盐粗品；
将得到的鸟氨酸盐酸盐粗品取IOOg按重量比15%的浓度溶解于去离子水中，升 温至80°C，加入粗品重量5%的活性炭，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出后，向浓缩液中 加入其4倍体积的酒精，冷却结晶，离心过滤去母液后用少量乙醇清洗晶体表面残留母液， 干燥后得成品。
实施例5
精氨酸酶的制备
取新鲜牛肝100g，于冰冻粉碎机内进行粉碎，细胞破壁，然后在4°C保存待用，取 IOOg牛肝浆溶解于250ml去离子水中，加入催化剂，催化剂为醋酸锰和氯化锰，有效催化成 分为Mn2+离子，且浓度控制在0. 3mmol/L,共热至55°C，保温1. 5小时，过滤、收集滤液，滤液 经高速离心后，立即存放于4°C冰箱中待用。
脲酶的制备
取新鲜黄豆100g，粉碎后，与30%体积百分比的乙醇混合，黄豆与乙醇质量百分 比为1 2. 5，然后在5°C下震荡10分钟，高速离心后取上清液，33°C使用，保温30分钟，保 存在4°C以下。
转化反应
将IOOg精氨酸干品溶于700ml去离子水中，用2N盐酸调节PH至8，升温至41°C， 加入60ml从新鲜牛肝中提取的牛肝酶液，加入触媒，触媒为硫酸锰和醋酸锰，有效催化成 分为Mn2+离子，Mn2+离子浓度控制在0. 5mmol/L，放入40°C恒温水域摇床中转化30小时；
将上述溶液取样，点板，点板展开剂为正丙醇和氨水，正丙醇和氨水质量百分比为 正丙醇氨水=72 28，待精氨酸斑点转化完全消失后，加入10ml/L的新鲜黄豆中提取的 脲酶，33°C保温反应50分钟后，滴加6N盐酸酸化至PH5，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出 后，向浓缩液中加入其3倍体积的酒精，80°C条件下回流Ih后，冷却结晶，离心过滤后得鸟氨酸盐酸盐粗品；
将得到的鸟氨酸盐酸盐粗品取IOOg按重量比20%的浓度溶解于去离子水中，升 温至75°C，加入粗品重量9%的活性炭，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出后，向浓缩液中 加入其3倍体积的酒精，冷却结晶，离心过滤去母液后用少量乙醇清洗晶体表面残留母液， 干燥后得成品。
在本文所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神和部分实验作举例说明。本发明 所属领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的 方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求
书所定义的范围。
8
权利要求
一种鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，其步骤包括A、将精氨酸干品作为底物溶于去离子水中配成转化液，用2N盐酸调节PH至7～10之间，升温至38℃～45℃，加入从新鲜牛肝中提取的牛肝酶液，加入触媒，放入38℃～45℃恒温水浴摇床中转化10～40小时；所述的触媒为Mn2+离子，Mn2+离子浓度控制在0.2～0.6mmol/L；B、将步骤A得到的溶液取样，点板，待精氨酸斑点转化完全消失后，加入5～20ml/L的新鲜黄豆中提取的脲酶，30℃～35℃保温反应40～70分钟后，滴加6N盐酸酸化至PH5～6之间，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出后，向浓缩液中加入其2～5倍体积的酒精，60℃～90℃条件下回流1h后，冷却结晶，离心过滤后得鸟氨酸盐酸盐粗品；点板展开剂为正丙醇和氨水，其质量百分比为正丙醇∶氨水＝65～75∶35～25；C、将步骤B得到的鸟氨酸盐酸盐粗品溶解于去离子水中，升温至70℃～80℃，加入粗品重量3～10％的活性炭，脱色过滤，浓缩至有少量晶体析出后，向浓缩液中加入其2～5倍体积的酒精，冷却结晶，离心过滤去母液后用少量乙醇清洗晶体表面残留母液，干燥后得成品。
2.根据权利要求
1所述的鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，其特征在于，所述的步 骤A中，溶液中加入牛肝酶液的量是以每IL转化液中，加入20ml 120ml的牛肝酶液。
3.根据权利要求
1所述的鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，其特征在于，所述的步 骤A中，转化液底物浓度控制在50 300g/L。
4.根据权利要求
1所述的鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，其特征在于，所述的触 媒为硫酸锰或醋酸锰或氯化锰。
5.根据权利要求
1所述的鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，其特征在于，所述的步 骤C中，鸟氨酸盐酸盐粗品按重量比10% 30%的浓度溶解于去离子水中。
6.根据权利要求
1或2或3或4或5所述的鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，其特 征在于，所述的步骤A中，牛肝酶液的制备方法为取新鲜牛肝于冰冻粉碎机内进行粉碎、 细胞破壁，然后在4°C保存待用，将牛肝浆溶解于1 4倍质量比的去离子水中，加入Mn2+离 子，且浓度控制在0. 2 0. 6mmol/L，共热至30 70°C之间，保温0. 5 2小时，过滤、收集 滤液，滤液经高速离心后，立即存放于4°C冰箱中待用。
7.根据权利要求
1或2或3或4或5所述的鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法，其特 征在于，所述的步骤B中脲酶的制备方法为将新鲜黄豆粉碎后，与30%体积百分比的乙醇 混合，黄豆与乙醇质量百分比为1 2 3，然后在0 10°C下震荡10分钟，高速离心后取 上清液，30 35°C使用，保温40 70分钟。
专利摘要
本发明涉及一种鸟氨酸盐酸盐制备方法，尤其是指一种鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法。本发明提供一种经济环保的鸟氨酸盐酸盐的双酶耦合制备方法。充分利用生物酶制得产品，区别现在大多数过多依赖化学试剂的生产方法。本发明采用新鲜黄豆中提取的脲酶和新鲜牛肝中提取的牛肝酶液制备鸟氨酸盐酸盐。
文档编号C12P13/00GKCN101348808 B发布类型授权 专利申请号CN 200810120055
公开日2011年1月12日 申请日期2008年7月17日
发明者吴培立, 周玉平, 孙军, 张勇, 张姝, 潘庆伟, 王雷, 缪铭, 黎法国 申请人:宁波市镇海海德生化科技有限公司;王雷导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),