B平板含有50mg/L Rif以及50-100mg/L待筛选的抗生素； ⑤ 28°C培养箱放置2天，挑选单克隆菌落PCR验证； ⑥ 经鉴定后含有目标质粒的农杆菌加20%甘油保存于-80°C。
[0014] 作为优选，上述的步骤4)包括以下的步骤： ① 将-80°C保存的甘油菌株在LB，LB平板含有50mg/LRif和50-200mg/L目标载体的 抗生素（hyg或G418 )，平板上划线，在28 °C下过夜培养活化； ② 挑单克隆在5ml的LB培养基，LB培养基含有50mg/LRif和50-100mg/L目标载体的 抗生素，摇菌； ③ 离心收集菌体，转入頂培养基中培养6小时至OD6J). 5,頂培养基中加 AS至200uM ; ④ 同时取从_80°C保存的黑粉菌甘油菌株在YH)培养基上划线活化，挑选单克隆在5ml 的液体Yro培养基上培养3天，转入新的Yro培养基中摇至0D_0.5备用； ⑤ 以共培养基制备固体平板，其上放置一张混合纤维素膜，将农杆菌OD6c?稀释到0. 2， 取IOOul的黑粉菌和IOOul的农杆菌混合均匀涂布于纤维素膜上，25°C培养2天； ⑥ 将混合纤维素膜取出放于筛选培养基YPD上，培养基YPD中含有50-200ug/ml hyg 或G418加200ug/ml特美汀，28°C培养3-5天，挑选生长的菌落做后续验证，验证其是否为 转化子。
[0015] 为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案： 上述的制备黑粉菌转化子菌株用于茭白育种的应用。
[0016] 本发明由于采用了上述的技术方案，采用农杆菌介导茭白黑粉菌，不需要制备复 杂的原生质体，受体来源简单，真菌的孢子、菌丝都可以直接用于转化；转化效率高；双元 载体与受体基因组无同源性时，T-DNA以随机插入的方式整合进基因组，当与受体基因组有 同源性时，相当数量的T-DNA以同源整合的方式插入基因组（Michielse and Hooykaas et al.，2005);另外，得到的转化子单拷贝比率也比较大，有利于获得标记基因。这使得T-DNA 标签法（T-DNA tagging)可以作为研究真菌基因功能和发育分子生物学的有效方法。
[0017] 进一步，本发明还转入了 GFP (绿色荧光蛋白这个外源基因)，除了便于作为转基因 检测外，可以直接通过追踪绿色荧光蛋白来追踪菌的侵染。也就是说，这个荧光蛋白基因既 是作为转基因成功的标记，又是作为菌的标记(在育种研究中用)，因为在植物中如果通过 显微镜直接观察菌丝是非常困难的，而染色法的步骤又比较繁琐，且由于处理方法的问题 带来实验的重复性，如果用GFP标记了菌株后，在激光共聚焦显微镜下，就可以直接观察到 菌在植物组织中的分布位置和密度，这在其它黑粉菌的研究中作为病害是有应用的。
【附图说明】
[0018] 图1为pCAMBIA1301质粒示意图。
[0019] 图2为本发明涉及的酶切位点。
[0020] 图3为利用Infusion技术构建pPK2表达载体流程图。
[0021] 图4~图9为构建用于茭白黑粉菌转基因的ρΡΚ2载体的流程图。
[0022] 图10为本发明黑粉菌转化子菌株的荧光分析图。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1载体系统构建 植物的表达载体一般不可以直接用于真菌，因为通常植物基因表达所需的启动子在真 菌中的启动效率和表达稳定性均存在问题。目前直接能用于真菌的载体很少，所以本发明 通过改造植物PCAMBIA1301表达载体来进行茭白黑粉菌的转基因。载体的改造主要有一、 用来自构巢曲霉gpda启动子和hsp70启动子替换植物表达载体中的35S启动子；二、便于 后续表达的检测，插入适用于真菌系统的sGFP报告基因；三、提供多种抗生素选择，本发明 主要有潮霉素抗性基因 hyg，可以用潮霉素进行有效筛选，以及新霉素磷酸转移酶II位点， 可以用G418 (遗传霉素）进行筛选。构建好的质粒经大肠杆菌复制并提取备用。
[0024] 如图1、图2所示，具体步骤如下： (1) 首先要考虑选择标记(抗生素基因）前的启动子替换，将gpdA和hsp70启动子序列 从现有其它基因载体中PCR扩增出来，在5'加上BstXI位点，在3'加上ApaI位点，克隆至 T载体； (2) 将pCambial301载体上含AatII的片段PCR扩增出来，在5'加上ApaI位点，在3' 加上其他合适的T载体上有的酶切位点，如KpnI，然后克隆至T载体或直接酶切； (3) 将含有启动子的T载体用ApaI和KpnI酶切，将含有AatII片段的PCR产物或T载 体用ApaI和KpnI酶切，将这两者连接，得到含有启动子和AatII片段的质粒。用BstXI和 AatII将启动子和AatII片段切出，连接至用BstXI和AatII酶切过的pCambial301载体。 这样就完成了潮霉素（hygromycin)前的35S启动子被替换，载体转化大肠杆菌菌株后，提 取质粒测序验证。
[0025] (4)接着要将多克隆位点（这个位点将来是要插入各种目的基因的）的EcoRI和 SacI位点之间插入真菌Hsp70启动子片段或gpda启动子片段，在HindIII和PstI位点之 间插入真菌的终止子trpc片段。在启动子hsp70和pgpda的5'端加上EcoRI酶切位点，在 3'端加上SacI酶切位点。在终止子Ttrpc的5'端加上PstI酶切位点，Ttrpc的3'端加 上HindIII酶切位点。将phsp70和pgpda启动子(两端酶切位点EcoRI与SacI)扩增连接 到pmdl9_T simple载体后用EcoRI与SacI双酶切，与第一目标中的载体EcoRI与SacI双 酶切片段连接后转化。新得到载体多克隆位点加入了真菌启动子，将phsp70和pgpda启动 子(两端酶切位点HindIII与PstI)扩增连接到pmdl9-T simple载体后用HindIII与PstI 双酶切，与多克隆位点已经插入启动子的载体HindIII与PstI双酶切后的片段连接后，最 终转化得到包含真菌启动子（gpda或hsp70)并包含潮霉素抗性位点的真菌表达载体。
[0026] 最后，对于绿色荧光蛋白基因 sgfp作为目的基因，则在PCR扩增时两头分别加入 SacI和PstI双酶切位点后，连接插入到多克隆位点中。而如果要提供别的抗生素作为选择 标记，如新霉素磷酸转移酶II位点，则只需按上述方法将该抗性基因加入潮霉素基因两端 相同的酶切位点进行替换即可。
[0027] 实施例2载体系统构建 我们也利用了不同于PCAMBIA1301的pPK2载体为骨架，通过Infusion的同源重组方 法（即Clontech的In-Fusion技术只要插入的DNA片段末端与载体末端具有15个同源碱 基序列就可以完成克隆重组）插入各种目的片段构建所需表达载体。具体步骤如下： 1) 利用PCAMBIA1301已构建好的真菌表达载体，用高保真Taq酶将EcoRI -Pgpda-SacI-GFP-Pstl-Ttrpc-Hindlll 片段扩增出来（所用引物为 PgpdaF02: GAATTCCGGAGAATATGGAGCTTCATCG，TtrpcR :AAGCTTTCGAGTGGAGATGTGGAGTG)，该片段可以结 合pmd-19 T simple载体作为中间载体，，标记为T-P1^iZa-Sgfp; 2) 对于将要替换的真菌启动子，如热激蛋白启动子Phsp70来自质粒质粒pMF2-lc 的碳源控制型启动子Pcrg7，来自质粒pMF2-2c的氮源控制型的启动子P/?ar7等，启动 子采用In-fusion方法可以不需要考虑酶切位点问题，在启动子两端加上T-P 1SPiZa-Sgfp 载体EcoRI和SacI两个酶切位点外侧同源的15bp碱基，按照实验方法将PCR扩增的 15bpLB-PcrglF-15bpRB，15bpLB- PNarl-15bpRB 与 EcoRI 和