核酸样品制备_2

方法（右上小图）和Epicentre? WaterMaster? DNA纯化程 序（左上小图）的对比。饼图是对MEGAN?数据库进行BLAST检索的10, 000个Illumina ? 测序读取的分布。如图所示，对于这两种方法，来源于大肠杆菌序列的测序读取的百分比相 似。在下方小图中的表格显示了在整个芯片上运行的大肠杆菌的测序覆盖度和品质，并与 按照制造商的方案在芯片外部运行的对照进行比较。
[0017] 图5示出了从细胞中分离核酸的示例性方法。
[0018] 图6示出了从包含细胞的流体中分离细胞外核酸的示例性方法。
[0019] 图7例示了由于本文公开的方法和装置而产生的ACEK(AC动电）力。在一些实施 方案中，通过利用由于介电电泳（DEP)、AC电热（ACET)流和AC电渗（ACEO)而对颗粒产生 的力之间的关系，使用大小截止值进行核酸的分离和纯化。分离依赖于流旋涡，由于取决于 流体电导率的ACET和ACE0,该流旋涡将使核酸更接近电极边缘。一旦颗粒处于DEP阱位 点，DEP阱将捕捉该颗粒，这取决于有效的斯托克斯半径。
[0020] 图8例示了如本文所公开的波浪形电极配置。在整个电极配置中，电极之间的边 缘到边缘距离是大致等距的。波浪形电极配置使电极的表面积最大化，同时保持了交变的 非均匀电场，以诱导产生ACEK梯度，从而能够产生DEP、ACE0、ACET和其他ACEK力。
[0021] 图9例示了在介电层边角处的E-场梯度如何基于氮化硅的厚度。较低的K和较 低的厚度导致在介电层拐角处较高的E-场梯度（弯曲度）。
[0022] 图10例示了在具有汽相沉积的水凝胶层的电极上的DNA捕获。活化的单体的汽 相涂层在多个基底上形成均勾的薄膜涂层。由GVD Corporation (Cambridge, MA)将水凝胶 如pHEMA以不同的厚度（100nm、200nm、300nm、400nm)和交联（5%、25%、40%)密度沉积在 电极芯片上。使用标准ACE规程（无预处理，7Vp-p，ΙΟΚΗζ，2分钟，0· 5XPBS，500ng/ml用 Sybr Green 1标记的gDNA)对水凝胶薄膜进行测试。通过成像捕获电极上的焚光。发现 IOOnm厚度、5 %交联的凝胶装置具有强DNA捕获。任选地，可通过改变沉积速率或利用粘附 促进剂如硅烷衍生物将生长锚定到微电极阵列的表面（即，到钝化层和暴露的电极）上对 该过程进行优化。 发明详沭
[0023] 本文描述了适于从流体组合物中分离或分开颗粒或分子的方法、装置和系统。在 具体的实施方案中，本文提供了用于从包含细胞或其他颗粒物质的流体中分离或分开核酸 的方法、装置和系统。在一些方面，所述方法、装置和系统可允许流体组合物中颗粒和分子 的快速分离。在其他方面，所述方法、装置和系统可允许从流体组合物中的颗粒中快速分离 分子。在多个方面，所述方法、装置和系统可允许需要最少量的物质和/或导致从复杂流体 如血液或环境样品中分离高纯度DNA的快速程序。
[0024] 在某些实施方案中，本文提供了用于从流体组合物中分离或分开颗粒或分子的方 法、装置和系统，所述方法、装置和系统包括将流体施加到包含电极阵列并能够产生AC动 电力（例如，当电极阵列通电时）的装置上。在一些实施方案中，介电电泳场是AC动电力 效应的组成部分。在其他实施方案中，AC动电力效应的组成部分为AC电渗或AC电热效应。 在一些实施方案中，包括介电电泳场的AC动电力包括高场区（正DEP，即存在由于非均匀电 场而导致的高密度电场线的区域）和/或低场区（负DEP，即存在由于非均匀电场而导致的 低密度电场线的区域）。
[0025] 在特定情况下，所述颗粒或分子（例如，核酸）在介电电泳场的场区（例如，高场 区）中进行分离（例如，从细胞中分离或分开）。在一些实施方案中，所述方法、装置或系 统进一步包括一个或多个以下步骤：使目标细胞集中在第一介电电泳场区（例如，DEP高场 区）内，在第一介电电泳场区内裂解细胞，和/或使核酸集中在第一或第二介电电泳场区 内。在其他实施方案中，所述方法、装置或系统包括一个或多个以下步骤：使细胞集中在第 一介电电泳场区（例如，DEP低场区）内，使核酸集中在第二介电电泳场区（例如，DEP高 场区）内，并洗去细胞和残余物质。所述方法还任选地包括能够执行一个或多个以下步骤 的装置和/或系统：洗涤或以其他方式从核酸中除去残余的（例如，细胞）物质（例如，当 核酸在阵列的高场DEP区内集中并保持时用水或缓冲剂漂洗阵列），降解残余蛋白质（例 如，来自裂解的细胞和/或其他来源的残余蛋白质，这样的降解根据任何合适的机制，例如 用热、蛋白酶或化学品进行），从核酸中冲洗降解的蛋白质，并收集核酸。在一些实施方案 中，本文描述的方法、装置的操作和系统的操作的结果是分离的核酸，该核酸任选地具有适 于DNA测序的量和纯度。
[0026] 在一些情况下，有利的是，本文所述的方法在短时间内进行，所述装置在短时间内 操作，并且所述系统在短时间内操作。在一些实施方案中，就根据从将流体加至装置到获得 分离的核酸之间的时间而测量的"程序时间"而言，这段时间是短的。在一些实施方案中， 程序时间少于3小时、少于2小时、少于1小时、少于30分钟、少于20分钟、少于10分钟或 少于5分钟。
[0027] 在另一方面，就根据从将流体加至装置到获得分离的核酸之间的时间，作为个人 必须处理该程序的累积时间长度而测量的"操作时间"而言，这段时间是短的。在一些实施 方案中，操作时间少于20分钟、少于10分钟、少于5分钟、少于1分钟或少于30秒。
[0028] 在一些情况下，有利的是，本文描述的装置包含单个容器，本文描述的系统包含含 有单个容器的装置，且本文描述的方法可在单个容器中，例如，在如本文描述的介电电泳装 置中进行。在一些方面，这样的单容器实施方案使流体处理步骤的数目最小化和/或在短 时间内进行。在一些情况下，本发明的方法、装置和系统与使用一个或多个离心步骤和/或 介质交换的方法、装置和系统形成对比。在一些情况下，离心增加了分离核酸所需的操作时 间。在另一方面，单容器程序或装置对核酸进行分离使用最少量的可消耗试剂。 装詈和系统
[0029] 在一些实施方案中，本文描述了用于从流体中收集核酸的装置。在一方面，本文描 述了用于从包含细胞或其他颗粒物质的流体中收集核酸的装置。在其他方面，本文公开的 装置能够从包含细胞或蛋白质物质的流体中收集和/或分离核酸。在其他情况下，本文公 开的装置能够从细胞物质中收集和/或分离核酸。
[0030] 在一些实施方案中，本文公开了一种用于从包含细胞或其他颗粒物质的流体中分 离核酸的装置，该装置包括：a.壳体；b.加热器或热源和/或包含蛋白质降解剂的容器；以 及c.在该壳体内的多个交流电（AC)电极，该AC电极被配置为选择性地通电以建立AC动电 高场区和AC动电低场区，借此AC动电效应使细胞集中在该装置的低场区内。在一些实施方 案中，所述多个电极被配置为选择性地通电以建立介电电泳高场区和介电电泳低场区。在 一些实施方案中，蛋白质降解剂是蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白质降解剂是蛋白酶K。 在一些实施方案中，所述装置进一步包括含有洗脱剂的第二容器。
[0031] 在一些实施方案中，本文公开了一种装置，该装置包括：a.多个交流电（AC)电极， 该AC电极被配置为选择性地通电以建立AC动电高场区和AC动电低场区；以及b.能够进 行热循环并进行PCR或其他酶反应的模块。在一些实施方案中，所述多个电极被配置为选 择性地通电以建立介电电泳高场区和介电电泳低场区。在一些实施方案中，所述装置能够 从包含细胞的流体中分离DNA并进行PCR扩增或其他酶反应。在一些实施方案中，在单个 腔室中分离DNA并进行PCR或其他酶反应。在一些实施方案中，在单个腔室的多个区内分 离DNA并进行PCR或其他酶反应。在一些实施方案中，在多个腔室中分离DNA并进行PCR 或其他酶反应。
[0032] 在一些实施方案中，所述装置进一步包括洗脱管、腔室和容器中的至少一种以进 行PCR扩增或其他酶反应。在一些实施方案中，在包含多个温度区的蛇形微通道中进行PCR 扩增或其他酶反应。在一些实施方案中，在截留于不混溶流体中的水性微滴中进行PCR扩 增或其他酶反应（即，数字PCR)。在一些实施方案中，热循环包括对流。在一些实施方案中， 所述装置包括接触或靠近电极的表面，其中该表面采用能够选择性地捕获生物分子的生物 配体进行功能化。
[0033] 在一些实施方案中，本文公开了一种用于从包含细胞或其他颗粒物质的流体中分 离核酸的系统，该系统包括：a.包含多个交流电（AC)电极的装置，该AC电极被配置为选择 性地通电以建立AC动电高场区和AC动电低场区，借此AC动电效应使细胞集中在该装置 的高场区内；以及b.用于对分离的或收集的核酸进行酶反应的测序仪、热循环仪或其他装 置。在一些实施方案中，所述多个电极被配置为选择性地通电以建立介电电泳高场区和介 电电泳低场区。
[0034] 在多个实施方案中，DEP场通过或能够通过如本文所述地使电极阵列选择性地通 电而产生。电极任选地由任何合适的耐腐蚀材料制成，该材料包括金属，如贵金属（例如 铂、铂铱合金、钯、金等）。在多个实施方案中，电极具有任何合适的尺寸、任何合适的取向、 任何合适的间距、以任何合适的方式通电或能够以任何合适的方式通电，等等，从而产生合 适的DEP和/或其他动电场。
[0035] 在一些实施方案中，本文描述了其中电极放置于单独的腔室中且通过AC DEP场穿 过孔或洞结构而在内部腔室中产生正DEP区和负DEP区的方法、装置和系统。使用多种几 何形状形成所期望的正DEP (高场）区和负DEP (低场）区以进行细胞、微粒、纳米颗粒和核 酸分离。在一些实施方案中，孔或洞结构包含（或填充有）多孔材料（水凝胶）或覆盖有 多孔膜结构。在一些实施方案中，通过将电极隔离到单独的腔室中，这样的孔/洞结构DEP 装置减少了在DEP过程中在内部分离腔室中发生的电化学效应、加热或混沌的流体运动。
[0036] 在一方面，本文描述了包含电极的装置，其中电极放置于单独的腔室中且通过穿 过孔结构在内部腔室中产生DEP场。示例性装置包括在壳体内的多个电极和含有电极的腔 室。如在PCT专利公开WO 2009/146143 A2(其公开内容并入本文）中所进一步描述的，装 置的控制器独立地控制电极。
[0037] 在一些实施方案中，采用多种孔和/或洞结构（纳米级、微米级，甚至大尺度）形 成腔室化的装置，并且该装置包含膜、凝胶或过滤材料，该膜、凝胶或过滤材料控制、限制或 防止细胞、纳米颗粒或其他实体扩散或转运到内部腔室中，但AC/DC电场、溶质分子、缓冲 液和其他小分子则可通过该腔室。
[0038] 在多个实施方案中，所述装置可以有多种配置。例如，包含较大的电极阵列（例 如，以正方形或矩形图案）的装置被配置为产生重复的非均匀电场，从而能够产生AC动电 学。仅为说明性目的，合适的电极阵列可包括但不限于10X10电极配置、50X50电极配置、 10X100电极配置、20X 100电极配置或20X80电极配置。
[0039] 这样的装置包括但不限于多路复用（multiplexed)电极和腔室化的装置、允许 产生可重新配置的电场图形的装置、组合了 DC电泳过程和流体过程的装置；样品制备 装置，样品制备、分离的核酸分子的酶处理及诊断装置（包括后续检测和分析），芯片实 验室（lab-on-chip)装置，定点照护（point-of-care)以及其他临床诊断系统或形式 (version)〇
[0040] 在一些实施方案中，平面铂电极阵列装置包括壳体，样品流体穿过该壳体流动。在 一些实施方案中，流体从入口端流向出口端，出口端任选地包括侧面的分析物出口。示例性 装置包括多个AC电极。在一些实施方案中，样品由微米大小的实体或细胞、较大的纳米颗 粒和较小的纳米颗粒或生物分子的组合组成。在一些情况下，较大的纳米颗粒是分散在样 品中的细胞碎肩。在一些实施方案中，较小的纳米颗粒是蛋白质、较小的DNA、RNA和细胞碎 片。在一些实施方案中，平面电极阵列装置为60 X 20的电极阵列，该电极阵列任选地被划 分为三个可单独控制但同时操作的20X20阵列。可选的辅助DC电极可接通正电荷，而可 选的DC电极接通负电荷，以达到电泳的目的。在一些情况下，在多个实施方案中，每个受控 的AC和DC系统以连续和/或脉冲的方式（例如，每个都能以相对较短的时间间隔启动和 关断脉冲）进行使用。沿着样品流侧面的可选的平面电极阵列在被纳米多孔材料（例如， 合成聚合物的水凝胶）层叠时，任选地用于产生DC电泳力以及AC DEP。此外，任选地使用 阵列中的平面电极和/或x-y-z维度的辅助电极在纳米孔层内进行微量电泳分离过程。
[0041] 在多个实施方案中，这些方法、装置和系统在1000Hz至IOOMHz的AC频率范围内、 在范围可为约1伏至2000伏pk-pk的电压、1伏至1000伏的DC电压、10微升/分钟至10 毫升/分钟的流速下以及在1°C至120°C的温度范围内进行操作。在一些实施方案中，所述 方法、装置和系统在约3至约15kHz的AC频率范围内进行操作。在一些实施方案中，所述 方法、装置和系统在5-25伏pk-pk的电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置 和系统在约1至约50伏/厘米的电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和 系统在约1至约5伏的DC电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在 约10微升至约500微升/分钟的流速下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和 系统在约20°C至约60°C的温度范围内进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系 统在1000Hz到IOMHz的AC频率范围内进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系 统在1000Hz到IMHz的AC频率范围内进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系 统在1000Hz到IOOkHz的AC频率范围内进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和 系统在1000Hz到IOkHz的AC频率范围内进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和 系统在IOkHz到IOOkHz的AC频率范围内进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和 系统在IOOkHz到IMHz的AC频率范围内进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和 系统在约1伏至1500伏pk-pk的电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和 系统在约1伏至1500伏pk-pk的电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和 系统在约1伏至1000伏pk-pk的电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和 系统在约1伏至500伏pk-pk的电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和 系统在约1伏至250伏pk-pk的电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系 统在约1伏至100伏pk-pk的电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统 在约1伏至50伏pk-pk的电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在 1伏至1000伏的DC电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在1伏至 500伏的DC电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在1伏至250伏的 DC电压下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在1伏至100伏的DC电压 下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在1伏至50伏的DC电压下进行操 作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在10微升/分钟到Iml/分钟的流速下进行 操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在10微升/分钟到500微升/分钟的流 速下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在10微升/分钟到250微升/ 分钟的流速下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在10微升/分钟到100 微升/分钟的流速下进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在1°C到KKTC 的温度范围内进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在20°C到95°C的温度 范围内进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在25°C到KKTC的温度范围内 进行操作。在一些实施方案中，所述方法、装置和系统在室温下进行操作。
[0042] 在一些实施方案中，控制器独立地控制每个电极。在一些实施方案中，控制器从外 部连接至所述装置，例如通过插座和插头连接，或者与装置壳体成为一体。
[0043] 本文还描述了鲁棒电极（robust electrode)按比例划分（x-y维度）的阵列以及 组合了 DEP、电泳和流体力的辅助电极的策略性放置（x-y-z维度）的排列，及其应用。在一 些实施方案中，在较高的离子强度和/或电导条件下更直接地分析临床相关体积的血液、 血清、血浆或其他样品。本文描述了用一个或多个多孔材料（天然的或合成的多孔水凝胶、 膜、受控的纳米孔材料和薄介电层状材料）层覆盖鲁棒电极结构（例如铂、钯、金等），以减 少可能在电极上或电极附近发生的任何电化学（电解）反应、加热和混沌的流体运动的效 应，但仍然允许对细胞、细菌、病毒、纳米颗粒、DNA和其他生物分子进行有效的分离。在一些 实施方案中，除了使用AC频率交叉点来达到更高分辨率的分离以外，还使用装置上（阵列 上）的DC微量电泳进行次级分离。例如，可通过阵列上的DC微量电泳来完成DNA纳米颗粒 (20-50kb)、高分子量DNA(5-20kb)、中等分子量DNA(l-5kb)以及较低分子量DNA(0. I-Ikb) 片段的分离。在一些实施方案中，所述装置被分为子部分（sub-sectioned)，任选地用于在 这样的装置上同时进行不同血细胞、细菌和病毒以及DNA的并行分离的目的。
[0044] 在一些实施方案中，所述装置包括壳体和加热器或热源和/或包含蛋白质降解剂 的容器。在一些实施方案中，加热器或热源能够将流体的温度提高到所需的温度（例如，提 高到适于降解蛋白质的温度，约30°C、40°C、50°C、60°C、70°C等）。在一些实施方案中，加热 器或热源适于作为PCR热循环仪进行操作。在其他实施方案中，加热器或热源用于保持恒 定的温度（等温条件）。在一些实施方案中，蛋白质降解剂是蛋白酶。在其他实施方案中， 蛋白质降解剂是蛋白酶K，且加热器或热源用于灭活蛋白质降解剂。
[0045] 在一些实施方案中，所述装置还包括在壳体内的多个交流电（AC)电极，该AC电极 能够被配置为选择性地通电以建立介电电泳（DEP)高场区和介电电泳（DEP)低场区，借此 AC动电效应使细胞集中在该装置的低场区内。在一些实施方案中，使电极选择性地通电以 提供第一 AC动电场区，并在随后或连续地选择性地通电以提供第二AC动电场区。例如，对 电极和细胞在DEP场中的集中的进一步描述参见PCT专利公开WO 2009/146143 A2,其公开 内容并入本文。
[0046] 在一些实施方案中，所述装置包括含有洗脱剂的第二容器。该洗脱剂为适于从装 置上洗脱分离的核酸的任何流体。在一些情况下，该洗脱剂是水或缓冲液。在一些情况下， 该洗脱剂包括DNA测序方法所需的试剂。
[0047] 本文还提供了包含多个交流电（AC)电极的系统和装置，该AC电极被配置为选择 性地通电以建立介电电泳（DEP)高场区和介电电泳（DEP)低场区。在一些情况下，AC动电 效应使细胞在DEP场的低场区内集中和/或使分子（例如，大分子，如核酸）在DEP场的高 场区内集中（或收集或分离）。
[0048] 本文还提供了包含多个直流电（DC)电极的系统和装置。在一些实施方案中，所述 多个DC电极包括至少两个分布在整个阵列上的矩形电极。在一些实施方案中，所述电极位 于阵列的边缘。在一些实施方案中，DC电极穿插在AC电极之间。
[0049] 在一些实施方案中，本文所描述的系统或装置包括用于处理核酸的器件（means)。 在一些实施方案中，本文所描述的系统或装置包括进行酶反应的器件。在其他实施方案中， 本文所描述的系统或装置包括进行聚合酶链反应、等温扩增、连接反应、限制性分析、核酸 克隆、转录或翻译分析或其他基于酶的分子生物学分析的器件。
[0050] 在一些实施方案中，本文所描述的系统或装置包含核酸测序仪。测序仪任选地为 任何合适的DNA测序装置，包括但不限于Sanger测序仪、焦磷酸测序仪（pyro-sequencer)、 离子半导体测序仪、聚合酶克隆测序仪、连接测序装置、DNA纳米球测序装置、连接测序装置 或单分子测序装置。
[0051] 在一些实施方案中，本文所述的系统或装置能够保持恒定的温度。在一些实施方 案中，本文所述的系统或装置能够使阵列或腔室冷却。在一些实施方案中，本文所述的系统 或装置能够加热阵列或腔室。在一些实施方案中，本文所述的系统或装置包括热循环仪。在 一些实施方案中，本文公开的装置包括局部温度控制元件。在一些实施方案中，本文公开的 装置能够感测和控制温度。
[0052] 在一些实施方案中，所述装置进一步包括加热或热元件。在一些实施方案中，加热 或热元件位于电极下方。在一些实施方案中，加热或热元件包括金属。在一些实施方案中， 加热或热元件包括钽、铝、钨或其组合。通常，通过加热或热元件所达到的温度与通过它的 电流成比例。在一些实施方案中，本文公开的装置包括局部冷却元件。在一些实施方案中， 将耐热元件直接放置在暴露的电极阵列的下方。在一些实施方案中，本文公开的装置能够 达到并保持约20°C至约120°C的温度。在一些实施方案中，本文公开的装置能够达到并保 持约30°C至约KKTC的温度。在其他实施方案中，本文公开的装置能够达到并保持约20°C 至约95°C的温度。在一些实施方案中，本文公开的装置能够达到并保持约25°C至约90°C、 约25°C至约85°C、约25°C至约75°C、约25°C至约65°C或约25°C至约55°C的温度。