体的，通过2. 7M氨水和1M柠檬酸水溶 液维持pH至7. 0 ;
[0047] 2)将四氢嘧啶转化液2按照步骤1)进行重复循环操作n次，n < 3。
[0048] 所述发酵罐为NBS Bi〇fl〇30006L发酵罐。
[0049] 所述菌体多批次重复使用合成四氢嘧啶的方法，还包括合并每次获得的离心去除 菌体后的四氢嘧啶转化液，进行胞外四氢嘧啶的抽提过程：取所述去除菌体后的四氢嘧啶 转化液8000rpm离心20分钟，取上清lml置于离心管中，加入lml氯仿剧烈振荡1小时， 13000rpm离心20分钟，上清移至新离心管中并置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢 嘧啶的干粉。
[0050] 本发明的再一个目的是提供一种制备四氢嘧啶的转化培养基，所述转化培养基由 溶质和溶剂组成，溶质及其在所述转化培养基中的浓度如下：
[0051] L-天冬氨酸钠 2M; 葡萄糖 l〇〇g/L; 甘油 l〇〇g/L; KC1 100g/L； 溶剂为水；
[0052] 或，一种制备四氢嘧啶的发酵培养基、补料培养基或诱导培养基：
[0053] 每 1L发酵培养基的配制：葡萄糖 10g，（NH4)2HP048g，KH2P0 413. 3g，MgS04.7H201. 2g， 柠檬酸1. 7g，微量盐溶液10mL，用水定溶至1L，5M NaOH调至pH7. 0 ;
[0054] 每1L补料培养基的配制：葡萄糖400g，MgS04 WHWlOg，微量盐溶液20mL，用水定 容至1L ;
[0055] 每 1L微量盐溶液的配制：FeS04 WHWlOg，ZnS04.7H2〇2. 25g，CuS04.511201& MnS04 4 H200. 5g，Na2B407 ? 10H200. 23g，CaCl2 ? 2H202g，（NH4)6M〇70240. lg，用 5M 盐酸定容，定容至 1L ;
[0056] 所述诱导培养基为在上述发酵培养基和/或补料培养基中，加入L-阿拉伯糖，使 得L-阿拉伯糖终浓度为lg/L ;
[0057] 或，一种制备四氢嘧啶的连续转化液，所述连续转化液由溶质和溶剂组成，溶质及 其在所述连续转化液中的浓度如下 ：
[0058] L-天冬氨酸钠 2()0niM; 葡萄糖 l()g/L; 甘油 l()g/L; KC! 10 g/L； 溶剂为l〇〇mM、pH 7. 0的PBS缓冲液。
[0059] 本发明的四氢嘧啶生物生产方法，菌体重复使用五次每升发酵菌体共可以合成胞 外四氢嘧啶87. 5克，合成效率达到11. 67g/L.d，均高于已报道的合成水平。因此本发明对 四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用具有重大意义。
【附图说明】
[0060] 图1为SDS-PAGE分析四氢嘧啶合成基因簇EctABC在大肠杆菌中的表达情况。
[0061] 图2为大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC中四氢嘧啶合成水平的分析。
[0062] 图3为高密度培养中葡萄糖的利用及菌体密度的分析。
[0063] 图4四氢嘧啶合成水平的分析。
[0064] 图5五批四氢嘧啶转化液中四氢嘧啶合成水平的分析。
【具体实施方式】
[0065] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0066] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0067] 延长盐单胞菌Halomonas elongate CGMCC No. 1. 6329购自中国普通微生物菌种 保藏管理中心（CGMCC)。
[0068] pBAD/HisA 购自 invitrogen，产品目录号为 V430-01 ;
[0069] 实施例1、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC的构建
[0070] ( -）、四氢嘧啶合成基因簇EctABC在大肠杆菌中的表达
[0071] 1、PCR扩增四氢嘧啶合成基因簇EctABC的编码序列
[0072] 以延长盐单胞菌H.elongate(CGMCC No. 1.6329)的基因组DNA为模板，用引物 EctABC-Pl、EctABC-P2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0073] EctABC-Pl :5, -CCTAGCTAGCATGAACGCAACCACAGAGCCCTTTA-3'
[0074] EctABC-P2 :5' -CCGCTGCAGTTACAGCGGCTTCTGGTCGTCGGCT-3'
[0075] 2、酶切、连接
[0076] 用Nhel和PstI双酶切PCR扩增产物，与预先使用Nhel和PstI双酶切的pBAD/ HisA质粒大片段进行连接，得到重组质粒。
[0077] 3、转化、筛选以及序列验证
[0078]用氯化钙化学转化法将上述制备的重组质粒转化至大肠杆菌DH5 a，用含有氨苄 青霉素（100 y g/ml)的LB培养基进行筛选培养，挑取单菌落，并进行扩大培养和提取质粒， 进行测序验证。测序结果表明，上述制备的重组质粒中含有具有如序列表中的SEQ ID Ns.l 所示核酸序列（即EctABC编码基因序列)的DNA片段，该序列分别编码具有序列表中SEQ ID N2 . 2-4所示氨基酸序列的3种蛋白（即四氢嘧啶合成中的三个关键酶：氨基丁酸乙酰基转 移酶EctA、二氨基丁酸氨基转移酶EctB、四氢嘧啶合成酶EctC)，与已报道的序列一致。上 述实验过程及结果证明构建的质粒及重组菌正确。将阳性克隆记作DH5 a -pBAD-ectABC， 阳性质粒记作pBAD-EctABC。质粒pBAD-EctABC的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID Ns . 5 所示。
[0079] 4、重组表达菌株的构建
[0080] 用氯化钙化学转化法将重组质粒pBAD-EctABC转化至大肠杆菌K-12系列表达菌 株 BW25113(rrnB3 AlacZ4787hsdR514 A (araBAD)567 A (rhaBAD)568rph-l)(购自 Thermo Cat#0EC5042)，用含有氨苄青霉素（100 y g/ml)的LB培养基进行筛选培养，挑取单菌落，获 得EctABC重组表达菌株。检测重组菌株合成四氢嘧啶的能力，将其中合成能力较差的一株 重组菌命名为大肠杆菌（Escherichia coli) BW-pBAD-ectABC' ；将其中合成能力较佳的一 株重组菌命名为大肠杆菌（Escherichia coli) BW-pBAD-ectABC将该合成能力较佳的大肠 杆菌（Escherichia coli) BW-pBAD-ectABC菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(简称CGMCC，保藏编号为CGMCC N0. 8334,保藏日期为2013年10月15日，分 类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。保藏中心的地址是北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，邮编100101。
[0081] 实施例2、大肠杆菌四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC中EctABC基因的表达
[0082] 挑取BW-pBAD-ectABC单菌落接入5ml含有氨苄青霉素（100 ii g/ml)的LB培养基 中，于37°C过夜培养。将过夜培养物lml接种于100ml含有氨苄青霉素（100ii g/ml)的LB 培养基，37°C剧烈振荡（200rpm)培养，至发酵液的0D_值达到0. 6-0. 8左右，向发酵体系中 加入L-阿拉伯糖（L-阿拉伯糖的终浓度为lg/L)，30°C条件下继续培养6小时。设含空载 体大肠杆菌BW-pBAD为阴性对照。
[0083] 发酵完毕后，5000rpm离心15分钟，收集菌体；用pH7. 0的PBS缓冲液重悬菌体， 超声波破碎后12,000rpm离心15min。收集上清液，即为含有目的蛋白的粗酶液，SDS-PAGE 检测蛋白表达情况。检测结果见图1。图1中，泳道1表示含空载体大肠杆菌BW-pBAD阴性 对照的检测结果；泳道2为四氢嘧啶高产菌株BW-pBAD-ectABC的检测结果。
[0084]实施例3、四氢嘧啶合成能力较佳菌株BW-pBAD-ectABC保藏编号为CGMCC N0. 8334的应用
[0085] (一 )、菌株发酵及生物转化法制备四氢嘧啶过程
[0086] 1、菌株发酵及EctABC基因的表达
[0087] 挑取BW-pBAD-ectABC单菌落接入20ml含有氨苄青霉素（100 ii g/ml)的LB培养基 中，于37°C过夜培养。将过夜培养物5ml接种于500ml含有氨苄青霉素（100 y g/ml)的LB 培养基，37°C剧烈振荡（200rpm)培养，至发酵液的0D_值达到0. 6-0. 8左右，再向发酵体系 中加入L-阿拉伯糖（L-阿拉伯糖终浓度为lg/L)，30°C条件下继续培养6小时5000rpm离 心15分钟，收集菌体。
[0088] 2、生物转化反应
[0089] 离心后菌体加入转化液，重悬菌体至0D_值达到10,取50ml重悬菌液于250ml三 角瓶中，30°C振荡（lOOrpm)反应24小时。
[0090] 转化液成分：100mM PBS缓冲液（pH7. 0)中含有200mM L-天冬氨酸钠、10g/L葡萄 糖、10g/L甘油、10g/L KC1。其中，lOOmM PBS缓冲液（pH7.0)的配制方法为：取380ml0. 1M 磷酸二氢钠水溶液加入620ml0. 1M磷酸氢二钠水溶液配制而成。
[0091] (二)、胞内四氢嘧啶的抽提
[0092] 上述生物转化反应完后，离心（8000rpm, 20分钟）收集上述转化后菌体，菌体 于-80°C中预冷30分钟后至于冷冻干燥仪中冻干，称重得干菌体160毫克。
[0093] 称取20mg冻干菌体，加入500ul抽提液(抽提液由体积比为10:5:4的甲醇、氯仿、 水组成)，剧烈震荡1小时，13000rpm离心20分钟促进分相。上清转移至新离心管中，加入 等体积的氯仿与水的混合液(氯仿与水的体积比为1:1 )，剧烈振荡1小时，再次13000rpm离 心20分钟，取上层水相至新离心管中，置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含有四氢嘧啶的 干粉。
[0094] 按上述方法提取胞内四氢嘧啶，直至将160毫克冻干菌体胞内四氢嘧啶提取完 全。
[0095] (三)、胞外四氢嘧啶的抽提
[0096] 离心（8000rpm离心20分钟)收集上清液500ul置于离心管中，加入500ul氯仿剧 烈振荡1小时，13000rpm离心20分钟，上清移至新离心管中并置于旋转蒸发仪中进行干燥， 得到含有四氢嘧啶的干粉。
[0097] 按上述方法提取胞外四氢嘧啶，直至将50ml反应