>[0143] 连续转化液：100mM PBS缓冲液（pH7. 0)中含有200mM L-天冬氨酸钠、10g/L的葡 萄糖、10g/L的甘油、10g/L的KC1 ;其中，PBS缓冲液（pH7. 0)的组成为：取380ml0. 1M磷酸 二氢钠溶液加入620ml0. 1M磷酸氢二钠溶液配置成100mM PBS缓冲液（pH7.0);所述溶液的 溶剂均为水。
[0144] 转化培养基：2M L-天冬氨酸钠，100g/L的葡萄糖、100g/L的甘油、100g/L的KC1 ; 所述溶液的溶剂均为水。
[0145] 转化条件：30°C (转化温度)，通过调整转速和通气量控制溶氧在20%以上(本实施 例搅拌速度为500转/分钟、通气量为2L/min)，2. 7M氨水和1M柠檬酸维持pH至7. 0左右
[0146] 二、利用上述第二轮四氢嘧啶转化液，按本实施例步骤一所述的方法再循环使用 菌体3轮，合成四氢嘧啶，按实施例5中的方法检测四氢嘧啶的合成量，检测结果见图5。
[0147] 如图5所示，第一轮转化1升发酵液获得胞外四氢嘧啶21克，第二轮转化1升发 酵液获得19. 6克胞外四氢嘧啶，第三轮转化1升发酵液获得17. 9克胞外四氢嘧啶，第四轮 转化1升发酵液获得16. 2克胞外四氢嘧啶，第五轮转化效率有所降低，1升发酵液获得胞外 四氢嘧啶12. 8克，5轮转化1升发酵液共获得胞外四氢嘧啶87. 5克。证明发酵所获菌体至 少可以重复使用4 一 5次。该方法合成四氢嘧啶的效率达到11. 67g/L. d明显高于现有其 它生产方法。
【主权项】
1. 一种制备四氨嚼巧的方法，包括在含k天冬氨酸轴的溶液中加入重组大肠杆菌，经 生物转化反应后即得；其中，所述重组大肠杆菌是表达了 SEQ ID Ns ;2所示蛋白、SEQ ID Nq ;3所示蛋白和SEQ ID Ns ;4所示蛋白的； 所述重组大肠杆菌为含有具有下述任一核巧酸序列的核酸片段的重组大肠杆菌： 1) 序列表中SEQ ID Ns ;1所示的核巧酸序列； 2) 编码序列表中SEQ ID Ns ;2、SEQ ID Ns ;3和/或SEQ ID Ns ;4所示蛋白质序列的 多核巧酸序列； 3) 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID Ns ;1限定的DNA序列杂交的核巧酸序列； 4) 与1)或2)或3)限定的核巧酸序列具有90% W上同源性，且编码相同功能蛋白质 的DNA序列；具体的，所述同源性为95% W上；再具体的为96% W上；再具体的为97% W上； 再具体的为98% W上；再具体的为99% W上。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌具体为大肠埃希氏菌 Escherichia coli BW-pBAD-ectABC CGMCC NO. 8334〇
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于；所述含k天冬氨酸轴的溶液由溶质 和溶剂组成，溶质及其在所述含k天冬氨酸轴的溶液中的浓度如下：
4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于；所述生物转化反应的条件包括：转 化温度为3(TC，控制生物转化反应体系的溶氧在20 % W上，和维持抑至7. 0。
5. 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述生物转化反应的过程包括： 将所述重组大肠杆菌进行诱导培养，得到含有表达了 SEQ ID Ns ;2所示蛋白、SEQ ID Nq: 3所示蛋白和SEQ ID Nq;4所示蛋白的重组大肠杆菌的诱导培养液；向所述诱导培养液中 加入所述含k天冬氨酸轴的溶液至k天冬氨酸轴终浓度为200mM ;转化培养至葡萄糖被 消耗完，开始补加所述含k天冬氨酸轴的溶液，所述含k天冬氨酸轴的溶液的流加速度为 40mLA，继续进行转化培养，继续转化培养过程中一直补加所述含k天冬氨酸轴的溶液； 转化培养结束即得四氨嚼巧转化液。
6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于；所述"将所述重组大肠杆菌进行诱 导培养，得到含有表达了 SEQ ID Ns;2所示蛋白、SEQ ID Ns;3所示蛋白和SEQ ID Ns;4所 示蛋白的重组大肠杆菌的诱导培养液"的方法包括下述1)和2): 1) 菌体培养过程：将300mL所述重组大肠杆菌的种子液接种于2.化含100 y g/ml氨 予青霉素的发酵培养基中，揽拌培养至葡萄糖消耗完时流加补料培养基，补料培养基的流 加速度为50mL/h，流加至菌体密度0D600达到50,菌体培养过程结束，进入诱导培养阶段； 2) 诱导培养过程：将上述菌体培养后的发酵液的温度降至3(TC，加入k阿拉伯糖，使 得k阿拉伯糖终浓度为Ig/l，进行诱导培养；诱导培养过程中要一直流加补料培养基，补 料培养基的流加速度调至20mLA ;当重组蛋白EctABC的表达量不再增加时，诱导培养过程
结束； 所述菌体培养的条件为：培养温度为37C，控制菌体培养体系的溶氧在20% W上，和 维持抑至7. 0 ; 所述诱导培养的条件为：培养温度为3(TC，控制诱导培养体系的溶氧在20% W上，和 维持抑至7. 0 ; 每1L发酵培养基的配制；葡萄糖lOg，（畑4)2册〇48径，KH2PO4I3. 3g，MgS〇4 *%01. 2g，巧 樣酸1. 7g，微量盐溶液10血，用水定溶至1L，5M化OH调至抑7. 0 ; 每1L补料培养基的配制；葡萄糖400g，M拆〇4 'y&OlOg，微量盐溶液20血，用水定容至 1L； 每 1L微量盐溶液的配制；FeS〇4 ?7H2〇10g, ZnS〇4 ?7&02. 25g, CuS〇4 巧&日山 MnS〇4 巧&日。. 5g，化2B4O7 ?lO&OO. 23g，CaCls ?甜2〇诚，（NH4)eM〇A4〇. Ig，用 SM 盐酸水溶液定容，定容至 IL。
7. 根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于；所述种子液的制备过程为；挑取 所述重组大肠杆菌单菌落接入20ml含有100 y g/ml氨予青霉素的LB培养基中，于37C、 20化pm培养12小时；然后将20ml培养物转接至300ml含有100 y g/ml氨予青霉素的种子 培养基中，37°C、200巧m振荡培养12小时，即得种子液； 所述种子培养基的配制；蛋白腺16g，酵母膏lOg，氯化轴5g，用水定容至1L，pH7. 0。
8. 根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述生物转化反应完后，还包括胞 内或胞外四氨嚼巧的抽提过程； 所述胞内四氨嚼巧的抽提过程包括： 取1ml所述四氨嚼巧转化液，800化pm, 20分钟离也收集菌体，菌体加入500 y 1抽提液， 所述抽提液由体积比为10:5:4的甲醇：氯仿：水组成，震荡1小时，13000巧m离也20分钟 促进分相；上清转移至新离也管中，加入等体积的体积比为1:1的氯仿：水，振荡1小时，再 次1300化pm离也20分钟，取上层水相至新离也管中，置于旋转蒸发仪中进行干燥，得到含 有四氨嚼巧的干粉； 所述胞外四氨嚼巧的抽提过程包括： 取所述四氨嚼巧转化液SOOOrpm离也20分钟，取上清1ml置于离也管中，加入1ml氯 仿振荡1小时，13000rpm离也20分钟，上清移至新离也管中并置于旋转蒸发仪中进行干燥， 得到含有四氨嚼巧的干粉。
9. 一种菌体多批次重复使用合成四氨嚼巧的方法，所述方法包括；将每3L按照权利要 求1-8任一所述的方法得到的四氨嚼巧转化液，按照下述步骤1)和2)操作： 1 )8000rpm，20分钟离也收集菌体，用化连续转化液重息菌体后置于发酵罐中，转化培 养至葡萄糖消耗完，开始补加转化培养基，转化培养基的流加速度为40mL/h，继续进行转化 培养，继续转化培养过程中一直补加转化培养基；转化培养结束即获得四氨嚼巧转化液2 ; 所述连续转化液由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述连续转化液中的浓度如下： 心天冬氨酸钢 200mM; 葡萄糖 lOg/L; 甘油 lOg/L; KC1 lOg/L 溶剂为lOOmM、巧7.0的现S缓冲液； 所述转化培养基由溶质和溶剂组成，溶质及其在所述转化培养基中的浓度如下： 心天冬氨酸钢 2M; 葡萄糖 lOOg/I^; 甘油 lOOg/k KC1 100呂/心 溶剂为水； 所述转化培养的条件包括：培养温度为3(TC，控制转化培养体系的溶氧在20% W上， 和维持抑至7. 0 ; 2)将四氨嚼巧转化液2按照步骤1)进行重复循环操作n次，n《3。
10. -种制备四氨嚼巧的转化培养基，所述转化培养基由溶质和溶剂组成，溶质及其在 所述转化培养基中的浓度如下： 心天冬氨酸納 2M; 葡萄糖 lOOg/k 甘油 lOOgA; 肪1 lOOg/L; 溶剂为水； 或，一种制备四氨嚼巧的发酵培养基、补料培养基或诱导培养基： 每1L发酵培养基的配巧[J ;葡萄糖lOg，（畑4)2册〇48径，KH2PO4I3. 3g，M拆〇4 *%01. 2g，巧 樣酸1. 7g，微量盐溶液10血，用水定溶至1L，5M化0H调至抑7. 0 ; 每1L补料培养基的配制；葡萄糖400g，M拆〇4 'y&OlOg，微量盐溶液20血，用水定容至 1L； 每 1L微量盐溶液的配制；FeS〇4 ?7H2〇10g，ZnS〇4 ?7^02. 25g，CuS〇4 巧&日山 MnS〇4 巧&日。. 5g，Na2B4〇7 ? lO&OO. 23g，CaCl2 ? 2H2〇2g，（NH4)eM〇7〇24〇. Ig，用 5M 盐酸定容，定容至 IL ; 所述诱导培养基为在上述发酵培养基和/或补料培养基中，加入k阿拉伯糖，使得 k阿拉伯糖终浓度为Ig/L ; 或，一种制备四氨嚼巧的连续转化液，所述连续转化液由溶质和溶剂组成，溶质及其在 所述连续转化液中的浓度如下： 心天冬氨酸钢 200mM; 葡萄糖 lOg/L; 甘油 lOg/L; KC1 lOg/L 溶剂为lOOmM、巧7.0的现S缓冲液。
【专利摘要】本发明提供了一种重组大肠杆菌高密度培养生产四氢嘧啶的方法，所述方法包括利用大肠埃希氏菌Escherichia coli BW-pBAD-ectABC，保藏编号为CGMCC NO.8334，将L-天冬氨酸钠经生物转化反应后即得。本发明的四氢嘧啶生物生产方法，菌体重复使用五次每升发酵菌体共可以合成胞外四氢嘧啶87.5克,合成效率达到11.67g/L.d，均高于已报道的合成水平。本发明提供的生产四氢嘧啶的方法，对四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用具有重大意义。CGMCC NO833420131015
【IPC分类】C12P17-12, C12R1-19
【公开号】CN104593442
【申请号】CN201310534045
【发明人】董志扬, 何永志, 张山, 毕建成
【申请人】南京众惠生物材料科技有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2013年11月1日