异性片段，扩增不出其它动物DNA限制性片 段
[0034] 1、实验前期，基于上述原则，并且将设计物与GenBank中羊、猪、牛、赤狐等线粒体 序列进行比对，初步判断所设计引物是只针对貉具有特异性，引物委托上海生工生物工程 公司代理合成。
[0035] 正向引物：5' -ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3'
[0036] 反向引物：5' -GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'
[0037] 2、引物合成后进行了一系列引物特异性验证扩增试验，摸索适宜扩增温度和反应 体系条件，确定特异性引物，作为试验用貉源性检验的引物。貉组织样本基因组提取，采用 线粒体基因组提取试剂盒提取DNA，购北京百浩生物科技有限公司。PCR扩增反应结果，用 琼脂糖凝胶电泳检测。实验结果表明，该引物有较强的特异性，可以作为貉源性成份检测的 特异性引物。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定，扩增序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0038] 将该序列与Genbank下载序列进行blast比对，对应序列相似度达99%，进一步说 明该扩增片段是貉源性特异性序列。
[0039] 二、貉源性DNA的PCR检测试剂盒的构建
[0040] 在获得的上述特异性引物对的基础上，设计用于貉DNA的PCR检测的试剂盒，试剂 盒包括检测溶液，该检测溶液中含10 X PCR缓冲液、I Ou mo I /L正向引物、I Ou mo I /L反向引 物、IOu mol/L dNTP、5U/yL TaqDNA聚合酶；其中，所述的引物序列为：
[0041] 正向引物：5' -ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3'
[0042] 反向引物：5' -GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'
[0043] 三、貉源性DNA的PCR检测方法的建立
[0044] 1、DNA样品的制备
[0045] (1)样品制备：
[0046] 肌肉样品：称取约200mg貉的肌肉组织切碎，用组织研磨器借助研磨成粉末状。
[0047] 饲料粉末样品：采用相同的液氮研磨方式，可直接用试剂盒提取线粒体DNA。
[0048] (2) DNA 提取
[0049] 线粒体基因组提取试剂盒提取DNA，购北京百浩生物科技有限公司。按照操作手册 步骤进行。
[0050] 2、PCR 反应
[0051] (1)反应体系：
[0052] 取3 μ L待测样品DNA溶液，上下游引物各I. 0 μ L，加入用于貉DNA的普通PCR检 测的试剂盒中的溶液rtaq mix酶25 μ L，再加入灭菌超纯水至总体积50 μ L ;将以上各组分 加入至0. 2mL PCR反应管中，5000r/min，离心IOs ;然后按下列条件参数进行PCR扩增。
[0053] (2)反应条件：
[0054] 预变性：94°C，3min ;
[0055] 进入循环：94°C变性30s, 58°C退火30s, 72°C延伸30s, 35次循环；
[0056] 终止延伸：72°C，IOmin ;
[0057] 4 °C保存反应产物。
[0058] 3、结果判断
[0059] 扩增产物电泳结果是以D2000bp marker对比，在250bp和500bp之间位置处出现 特异性扩增条带为阳性，没有特异性扩增条带为阴性。
[0060] 4、扩增貉DNA产物序列分析：
[0061] 将貉PCR扩增产物进行纯化后送上海生工生物工程有限公司进行测序。PCR特异 性扩增产物的测序结果如SEQ ID NO. 9所示。
[0062] 实施例2PCR检测方法对肉类样品中貉源性成分DNA的特异性检测
[0063] 针对市场中会出现的以貉肉类冒充其他肉制品的现象，本试验从特异性引物扩增 片段的角度检测貉源性成分，以期能够为检测肉制品中是否掺杂了貉肉提供一种鉴定方 法，为质检部门提供一种分子检测手段。市场中购买了羊肉、牛肉、猪肉并提取了基因组备 用，毛皮动物养殖场采集了水貂、蓝狐组织样本。肌肉组织提取DNA采用前面提到的试剂盒 完成。采用实施例1的含有特异性引物的检测试剂盒及检测方法检测貉DNA样品。同时检 测蓝狐、水貂等其他毛皮动物DNA样品，以此方法的特异性进行评估。
[0064] 特异性检测结果如图1所示。从图1中可以看出，只有貉的泳道在250bp和500bp 之间位置处出现了特异性扩增条带，而其他物种的泳道均为出现特异性扩增条带。这一试 验结果表明：本发明所设计引物只对貉DNA的特异性扩增引物，对于试验中涉及的羊、牛、 蓝狐、水貂、猪和犬等源性成分基因组DNA没有特异性扩增条带，能够达到检测貉源性成分 的效果。
[0065] 实施例3貉DNA的PCR检测方法灵敏度检测
[0066] 将制备的貉基因组DNA进行梯度稀释，该样本的浓度测定值为0,01ug/ul，分别稀 释至10%，1%，0. 1%，0. 01%，0. 001%，0. 0001%，按照实施例1中的试剂盒和方法对该 稀释的溶液DNA用于进行检测灵敏度分析。按照实施例1提供的PCR扩增条件进行试验， 结果如图2所示。从图2中可以看出，当浓度稀释至原浓度的0. 001 %时仍可检出貉源性成 分，经分析计算可知检出限为KT8UgAil。
[0067] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此 技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保 护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种检测貉源性物种成分的特异性引物，其特征在于，以貉属物种的线粒体全基因 组序列为参考序列，筛选出貉线粒体基因组中进化速率较快的区段，根据相应区段设计引 物，最后对引物进行特异性验证后筛选出的引物。
2. 权利要求1所述特异性引物，其特征在于，是以GeneBank:NC-013700. 1区段为模板 设计得到的特异性引物。
3. 权利要求2所述特异性引物，其特征在于，正向引物和反向引物的核苷酸序列如下： 正向引物：5' -ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3' 反向引物：5' -GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'。
4. 权利要求2所述特异性引物，其特征在于，引物目标扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9 所示。
5. 权利要求2所述特异性引物用于检测肉制品、饲料和毛皮产品中的貉源性物种成 分。
6. 权利要求5所述方法，其特征在于，所述引物扩增的条件为：预变性：94°C，3min ;进 入循环：94°0变性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸3〇8,35次循环；终止延伸 ：721：，1〇111111;4°〇 保存反应产物。
7. 含有权利要求1所述特异性引物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括10 x PCR 缓冲液、l〇umol/L正向引物、10umol/L反向引物、10umol/L dNTP和5U/uL TaqDNA聚合酶。
8. 权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括10 x PCR缓冲液、10umol/L 正向引物、l〇umol/L反向引物、10umol/L dNTP和5U/uL TaqDNA聚合酶； 其中，正向引物：5' -ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3' 反向引物：5' -GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'。
9. 权利要求7所述试剂盒用于检测肉制品、饲料和毛皮产品中的貉源性成分。
10. 权利要求9所述方法，其特征在于，所述引物扩增的条件为：预变性：94°C，3min ; 进入循环：94°0变性3〇8,581：退火3〇8,721：延伸3〇8,35次循环；终止延伸 ：721：，1〇111111; 4°C保存反应产物。
【专利摘要】本发明公开了一种检测貉源性物种成分的特异性引物及其应用，属于动物源性成分特异性检测技术领域。本发明所提供的检测貉源性成分的特异性引物的正向引物和反向引物分别为：正向引物：5'-ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3'；反向引物：5'-GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'。本发明还提供了含有特异性引物的试剂盒以及利用特异性引物检测肉制品、饲料和毛皮类产品中貉源性成分的方法。本发明所提供的方法具有操作方便快速、特异性强、检测条件要求低、灵敏度高的特点，分析检出限可达10-8ug/ul，适用于肉制品、饲料和毛皮类产品中貉源性成分的检测。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104611455
【申请号】CN201510092834
【发明人】孙伟丽, 李光玉, 王卓, 刘晗璐, 钟伟, 杨雅涵, 樊燕燕
【申请人】中国农业科学院特产研究所
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年3月2日