用于正烷烃重组生物合成的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于正烧炫重组生物合成的方法和组合物
[0001] 本申请是申请日为2010年07月09日和发明名称为"用于正焼姪重组生物合成的 方法和组合物"的201080031073. 7号发明专利申请的分案申请。
[0002] 巧关申请的帘叉引巧
[0003] 本申请要求在先的2009年7月9日提交的美国临时专利申请61/224, 463号，2009 年7月27日提交的美国临时专利申请61/228,937号和2010年4月13日提交的美国发明 专利申请12/759, 657号的优先权，其公开纳入本发明作为参考。
技术领域
[0004] 本发明涉及赋予异养或光合自养宿主焼姪产生性能的方法，W使得修饰后的宿主 可W被用于生物焼姪化ioalkane)的商业生产。
【背景技术】
[0005] 许多现有的光合自养生物（即，植物、藻类和光合细菌）不适合工业的生物工艺， 且因此没有显现出商业上的可行性。相比工业化异养生物如大肠杆菌（20分钟），该样的生 物通常具有较长的倍增时间（3-72小时），反映了低的总生产率。虽然高效生物合成生产燃 料的渴求已导致开发出产生脂肪酸的烷基醋的光合微生物，但仍然存在对使用光合生物产 生姪如焼姪的方法的需求。
[0006] 发明概沐
[0007] 本发明在特定实施方式中提供了包含选自AAR和ADM酶的编码序列、作为该些序 列的密码子优化变体的核酸序列及相关核酸序列和片段所组成的组的核酸序列或由其组 成的分离的多核巧酸。
[0008] AAR酶是指具有SYNP(X7942_1594蛋白（SEQ ID NO ;6)或其同源物的氨基酸序列 的酶，其中SYNPCC7942_1594同源物是其BLAST比对（i)覆盖>90%的SYNPCC7942_1594长 度，（ii)覆盖>90%匹配蛋白质长度，和（iii)与SYNPCC7942_1594具有乂0%的同一性（当 最佳地使用本发明提供的参数优化比对时），并保持SYNPCC7942_1594的功能活性（即将醜 基-ACP(ACP=醜基载体蛋白）转化为焼酵）的蛋白质。ADM酶是指具有SYNPCC7942_1593 蛋白（SEQ ID NO ;8)或其同源物的氨基酸序列的酶，其中SYNPCC7942_1593同源物定义为 其氨基酸序列比对（i)覆盖>90%的SYNPCC7942_1593长度，（ii)覆盖>90%匹配蛋白长 度，和（iii)与SYNPCC7942_1593具有乂0%的同一性（当最佳地使用本发明提供的参数比 对时），并保持SYNPCC7942_1593的功能活性（即将n-焼酵转化为（n-1)-焼姪）的蛋白 质。示例性的AAR和ADM酶分别列于表1和表2中。编码AAR或ADM酶的基因在本文中分 别被称为AAR基因（aar)或ADM基因（adm)。
[0009] BLAS化优选的参数为；期望值10 ;(默认）；过滤器：无；开放空位罚分（Cost to open a gap) ;11(默认）；扩展空位罚分（Cost to extend a gap) ;1(默认）；最大比对： 1〇〇(默认）；字段大小；11 (默认）；描述编号；1〇〇(默认）；罚分矩阵龙L0WSUM62。
[0010] 虽然申请人在本申请中提及焼酵脱駿单加氧酶，但申请人该样做并非意图局限于 任何特定的反应机制，除非明确提出。例如，SYNPCC7942_1593或任何其他ADM基因编码的 酶是否实现脱撰酶或脱駿反应不影响发明人的该发明的效用，除非本文中明确给出了相反 的表不。
[0011] 本发明还提供了包含选自由表1和表2中所列序列及相关多肤序列、片段和融合 体组成的组的多肤序列或由该多肤序列组成的分离的多肤。特异性结合本发明的分离的多 肤的抗体也被包括在本发明中。
[001引本发明也提供了用于在缺乏AAR和ADM催化活性的宿主细胞中表达编码AAR和 ADM的异源核酸序列（从而赋予该宿主细胞产生正焼姪（n-a化ane)的能力）的方法，或用 于在含有天然AAR和/或ADM活性的宿主细胞中表达编码AAR和ADM的核酸（从而增强宿 主细胞产生正焼姪的能力）的方法。
[0013] 此外，本发明提供了使用本发明描述的AAR和ADM基因、蛋白和宿主细胞生产感兴 趣的碳基产物的方法。例如，在一个实施方式中，本发明提供了一种生产姪类的方法，包括： (i) 在培养基中培养工程蓝细菌，其中所述的工程蓝细菌包含重组AAR酶和重组ADM酶；和 (ii) 使所述工程蓝细菌暴露于光和二氧化碳，其中所述暴露导致所述工程蓝细菌将所述二 氧化碳转化为正焼姪，其中至少一种所述正焼姪选自由正十H焼、正十四焼、正十五焼、正 十六焼和正十走焼组成的组，其中产生的所述正焼姪的量在0. 1%到5%细胞干重之间，并 且至少为由在相同条件下培养的、但缺乏所述重组AAD酶和ADM酶的而其它方面相同的蓝 细菌所产生量的两倍。
[0014] 在相关的实施方式中，工程蓝细菌产生的正焼姪的量为至少0. !%、0. 2%、0. 3%、 0. 4%、0. 5%、0. 6%、0. 7%、0. 8%、0. 9%或1% DCW，并且至少为由在相同条件下培养的、 缺乏所述重组AAD酶和ADM酶的而其它方面相同的蓝细菌产生的量的两倍。
[0015] 在相关的实施方式中，至少一种所述重组酶与所述工程蓝细菌异源。在另一个实 施方式中，所述蓝细菌在没有一种或两种重组酶的表达时不合成焼姪。在另一个实施方式 中，至少一种所述重组AAR或ADM酶不是与所述工程蓝细菌异源的。
[0016] 在该方法的另一个相关实施方式中，所述工程蓝细菌还产生至少一种正帰姪或 正焼醇。在再另一个实施方式中，工程蓝细菌产生至少一种选自由正十五帰、正十走帰和 1-十八醇组成的组的正帰姪或正焼醇。在相关实施方式中，所述正焼姪主要包括正十走 焼、正十五焼或其组合。在相关实施方式中，产生了比所有其他正焼姪产物之和更多的正 十走焼和/或正十五焼。在再另一个相关实施方式中，工程蓝细菌产生了比工程蓝细菌产 生的任何其他正焼姪或正帰姪更多的正十走焼和/或正十五焼。在再另一个相关实施方 式中，所述工程蓝细菌产生的至少一种正十五帰选自由顺式-3-十走帰和顺式-4-十五 帰组成的组。在再另一个相关实施方式中，所述工程蓝细菌产生的至少一种正十走帰选 自由顺式-4-十五帰、顺式-6-十走帰、顺式-8-十走帰、顺式-9-十走帰和顺式，顺 式-十走-二-帰组成的组。
[0017] 在再另一个相关实施方式中，本发明还提供了从所述工程蓝细菌或所述培养基中 分离至少一种正焼姪、正帰姪或正焼醇的步骤。在再另一个相关实施方式中，工程蓝细菌在 液体培养基中培养。在再另一个相关实施方式中，工程蓝细菌在光生物反应器中培养。
[0018] 在另一个相关实施方式中，AAR和/或ADM酶由质粒编码。在再另一个相关实施 方式中，AAR和/或ADM酶由整合入所述工程蓝细菌基因组中的重组基因编码。在再另一 个相关实施方式中，AAR和/或ADM酶由在所述工程蓝细菌上W多个拷贝存在的基因编码。 在再另一个相关实施方式中，重组AAR和/或ADM酶由作为操纵子的部分的基因编码，其中 所述基因的表达由单一启动子控制。在再另一个相关实施方式中，重组AAR和/或ADM酶由 各自的启动子控制下独立表达的基因编码。在再另一个相关实施方式中，工程蓝细菌中重 组AAR和/或ADM酶的表达受到选自由cl启动子、cpcB启动子、lacl-trc启动子、EM7启 动子、aphll启动子、nirA启动子和nir07启动子（本发明中称为"P(nir07)")组成的组 的启动子控制。在再另一个相关实施方式中，酶由作为操纵子的部分的基因编码，其中所述 基因的表达由一个或多个诱导型启动子控制。在再另一个相关实施方式中，至少一个启动 子是尿素抑制、硝酸盐诱导的启动子。在再另一个相关实施方式中，尿素抑制、硝酸盐诱导 的启动子是nirA型启动子。在再另一个相关实施方式中，nirA型启动子是P(nir07) (SEQ ID NO ; 24)。
[0019] 在再另一个相关实施方式中，被工程化W表达重组AAR和/或ADM酶的蓝细菌种 在不存在所述重组AAR和/或ADM酶时产生少于约0. 01 % DCW的正十走焼或正十五焼， 0. 01% DCW大致对应于用本文描述的气相色谱/火焰电离检测方法检测正十走焼和正十五 焼的检测限。在另一个相关实施方式中，该方法的工程蓝细菌是嗜热的。在再另一个相关 实施方式中，该方法的工程蓝细菌选自由工程化的聚球藻（Synechococcus)PCC7002和工 程化的细长嗜热聚球藻（Thermosynechococcus elonga1:us)BP-l组成的组。
[0020] 在再另一个相关实施方式中，重组AAR和/或ADM酶分别选自由表1和表2中所 列酶的组。在再另一个相关实施方式中，重组AAR酶选自由SYNPCC7942_1594、tlll312、 PMT9312_0533和cce_1430组成的组。在再另一个相关实施方式中，重组ADM酶选自由 SYNPCC7942_1593、tlll313、PMT9312_0532 和 cce_0778 组成的组。
[0021] 在再另一个相关实施方式中，重组AAR和ADM酶分别具有SEQ ID NO ;10和SEQ ID NO; 12的氨基酸序列。在特定实施方式中，重组AAR和ADM酶分别由SEQ ID NO ;9和11编 码。在再另外的相关实施方式中，重组AAR和ADM酶分别由SEQ ID NO ;26和28,或分别由 SEQ ID NO ;30和31编码，并分别具有SEQ ID NO ;27和28的氨基酸序列。在特定实施方 式中，重组AAR和ADM酶分别由SEQ ID N0;1和3编码，并分别具有SEQ ID N0;2和4的氨 基酸序列。在再另外的实施方式中，重组AAR和ADM酶分别由SEQ ID N0;5和7编码，并分 别具有SEQ ID NO ;6和8的氨基酸序列。
[0022] 在再另一个相关实施方式中，该方法包括在抗生素的存在下培养工程蓝细菌，其 中所述抗生素对于编码AAR和/或ADM酶的重组基因的存在进行选择。在特定实施方式 中，抗生素是壮观霉素或卡那霉素。在相关实施方式中，培养基中壮观霉素的量在100到 700y g/ml之间，如可W加入100、200、300、400、500、600、或700113/1111的壮观霉素到培养 基中。在特定实施方式中，加入的壮观霉素的量约为600 y g/ml，而工程蓝细菌产生的正焼 姪的量为至少3%、4%或5% DCW。
[0023] 在另一个实施方式中，生产姪的方法包括在用于一种或两种酶的外源底物存在下 培养表达重组AAR和/或ADM酶的工程蓝细菌。在相关实施方式中，底物选自由醜基-ACP、 醜基-CoA和脂肪酵组成的组。在另一个相关实施方式中，外源脂肪醇或脂肪醋或其他间接 底物可W被加入并被蓝细菌转化为醜基-ACP或醜基-CoA。
[0024] 在再另一个实施方式中，本发明提供了包含由本发明描述的任何重组生物合成方 法产生的正焼姪的组合物。在再另一个实施方式中，本发明提供了包含由本发明描述的任 何重组生物合成方法产生的正帰姪或正焼醇的组合物。
[0025] 在特定实施方式中，本发明提供了用于产生正焼姪的工程化宿主细胞，其中所述 细胞包含一种或多种选自由醜基-CoA还原酶活性、醜基-ACP还原酶活性、焼酵脱駿单加氧 酶活性和电子供体活性组成的组的重组蛋白活性。在相关实施方式中，宿主细胞包含重组 醜基-ACP还原酶活性、重组焼酵脱駿单加氧酶活性和重组电子供体活性。在其他实施方式 中，宿主细胞包含重组醜基-ACP还原酶活性和重组焼酵脱駿单加氧酶活性。在特定实施方 式中，电子供体活性是铁氧化还原蛋白。在特定的相关实施方式中，宿主细胞能进行光合作 用。在再其他的相关实施方式中，宿主细胞是蓝细菌。在再其他实施方式中，宿主细胞是革 兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌或酵母菌。
[0026] 在其他实施方式中，本发明提供了包含选自由W下序列组成的组的核酸序列或由 该核酸序列组成的分离的或重组的多核巧酸；(a)SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、14、30或 31 ;(b)作为SEQ ID No ;1、3、5、7、9、11、13、14、30或31的简并变体的核酸序列；（c)与 SEQ ID 齡；1、3、5、7、9、11、13、14、30或31至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至 少98%、至少99% %、至少99. 1 %、至少99. 2%、至少99. 3%、至少99. 4%、至少99. 5%、至 少99. 6%、至少99. 7%、至少99. 8%或至少99. 9%相同的核酸序列；（d)编码具有SEQ ID ^;2、4、6、8、10、12、27或29的氨基酸序列的多肤的核酸序列；（6)编码与569 10^;2、 4、6、8、10、12、27 或 39 至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%、至少 95%、 至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99. 1 %、至少99. 2%、至少99. 3%、至少 99. 4%、至少99. 5%、至少99. 6%、至少99. 7%、至少99. 8%或至少99. 9%相同的多肤的核 酸序列；和（f)与SEQ ID齡；1、3、5、7、9、11、13、14、30或31在严格条件下杂交的核酸序 列。在相关实施方式中，该核酸序列编码具有醜基-ACP还原酶活性或焼酵脱駿单加氧酶活 性的多肤。
[0027] 在再另一个实施方式中，本发明提供了具有焼酵脱駿单加氧酶活性的分离的可溶 性多肤，其中在特定的相关实施方式中，多肤具有表2中所列蛋白质之一的氨基酸序列。在 相关实施方式中，多肤具有与SEQ ID NO ;4、8、12或29相同的或至少95%相同的氨基酸序 列。
[002引在再另一个实施方式中，本发明提供了在体外从醜基-ACP合成正焼姪的方法，包 括；使醜基-ACP与重组醜基-ACP还原酶接触，其中所述醜基-ACP还原酶将所述醜基-ACP 转化为正焼酵；然后在电子供体存在下将所述正焼酵与重组的可溶性焼酵脱駿单加氧酶接 触，其中所述焼酵脱駿单加氧酶将所述n-焼酵转化为（n-1)焼姪。在相关实施方式中，本 发明提供了在体外从正焼酵合成正焼姪的方法，包括；在电子供体存在下将所述正焼酵与 重组的可溶性焼酵脱駿单加氧酶接触，其中所述焼酵脱駿单加氧酶将所述n-焼酵转化为 (n-1)焼姪。在特定的相关实施方式中，电子供体是铁氧化还原蛋白。
[0029] 在另一个实施方式中，本发明提供了包含重组AAR和ADM酶的工程蓝细菌细胞，其 中所述细胞包含0. 1 %到5%之间、1 %到5%之间或2%到5%之间细胞干重的正焼姪，其中 所述正焼姪主要是正十五焼、正十走焼或其组合。
[0030] 在其他实施方式中，本发明提供了本发明公开的表达和/或转化载体之一。在其 他相关实施方式中，本发明提供了使用本发明公开的表达和/或转化载体之一转化微生 物，如蓝细菌的方法。
[003。 在生产姪类的方法的再另一个实施方式中，AAR和ADM酶分别与SEQ ID NO ;6和 SEQ ID NO ;8至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同。在相 关实施方式中，工程蓝细菌产生正十五焼和正十走焼，其中正十五焼相对于正十五焼加正 十走焼的质量百分比至少为20%。在再另一个相关实施方式中，工程蓝细菌产生正十五焼 和正十走焼，其中正十五焼相对于正十五焼加正十走焼的质量百分比小于30%。在另一个 相关实施方式中，工程蓝细菌产生正十五焼和正十走焼，其中正十五焼相对于正十五焼加 正十走焼的质量百分比在20%和30%之间。
[003引在生产姪类的方法的再另一个实施方式中，AAR和ADM酶分别与SEQ ID NO ;10和 SEQ ID NO ;12至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同。在相 关实施方式中，工程蓝细菌产生正十五焼和正十走焼，其中正十五焼相对于正十五焼加正 十走焼的质量百分比至少为50%。在再另一个相关实施方式中，正十五焼相对于正十五焼 加正十走焼的质量百分比小于60%。在再另一个相关实施方式中，正十五焼相对于正十五 焼加正十走焼的质量百分比在50%和60%之间。
[0033] 在生产姪类的方法的再另一个实施方式中，工程蓝细菌包含至少两种不同的重组 ADM酶和至少两种不同的重组AAR酶。在相关实施方式中，所述工程蓝细菌包含至少一种编 码分别与SEQ ID NO ;27和SEQ ID NO ;29至少95%相同的AAR和ADM酶的操纵子。在再 另一个相关实施方式中，所述工程蓝细菌包含至少一种编码分别与SEQ ID NO ;10和SEQ ID NO ; 12至少95 %相同的AAR和ADM酶的操纵子。在再另一个相关实施方式中，所述AAR和 ADM酶的表达受诱导型启动子，如P (nir07)启动子的控制。在再另一个相关实施方式中，所 述重组ADM酶和AAR酶是染色体整合的。在再另一个相关实施方式中，所述工程蓝细菌在 诱导物的存在下产生正焼姪，且其中至少95%的所述正焼姪为正十五焼和正十走焼，而且 其中正十五焼相对于正十五焼加正十走焼的质量百分比为至少80%。
[0034] 在生产姪类的方法的再另一个实施方式中，工程蓝细菌包含分别与SEQ ID NO ; 10 和SEQ ID NO; 12至少95 %相同的重组AAR和ADM酶。在相关实施方式中，重组AAR和ADM 酶在诱导型启动子，如P(nir07)启动子的控制之下。在再另一个相关实施方式中，工程蓝 细菌在诱导物的存在下产生至少0. 5 % DCW的正焼姪，其中所述正焼姪包括正十五焼和正 十走焼，且其中正十五焼相对于正十五焼加正十走焼的质量百分比为至少50%。
[00巧]在再另一个实施方式中，本发明提供了一种调节工程蓝细菌中正十五焼和正十走 焼的相对量的方法，包括控制所述工程蓝细菌中一种或多种重组AAR和/或ADM酶的表达， 其中所述AAR和/或ADM酶与SEQ ID N0:10、12、27或29的AAR和ADM酶至少95%相同或 者相同。
[0036] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种工程蓝细菌，其中所述工程蓝细菌包含 编码AAR酶、ADM酶或该两种酶的一个或多个重组基因，其中至少一个所述重组基因在硝酸 盐诱导启动子的控制之下。
[0037] 在再另一个实施方式中，本发明提供了重组基因，其中所述基因包含用于控制所 述基因的表达的启动子，其中所述启动子包含与SEQ ID NO ;24相同的连续核酸序列。
[0038] 在再另一个实施方式中，本发明提供了包含启动子的分离的DNA分子，其中所述 启动子包含与SEQ ID NO ;24相同的连续核酸序列。
[0039] 在再另一个实施方式中，本发明提供了选自由JCC1469、JCC1281、JCC1683、 JCC1685、JCC1076、JCC1170、JCC1221、JCC879 和 JCC1084t 组成的组的工程菌株。
[0040] 本发明的该些W及其他实施方式在此在附图、说明、实施例和权利要求中进一步 描述。
[0041] 特别地，本发明涉及W下各项：
[0042] 1. 一种生产姪类的方法，包括：
[0043] (i)在培养基中培养工程蓝细菌，其中所述的工程蓝细菌包含重组醜基-ACP还原 酶和重组焼酵脱駿单加氧酶；和
[0044] (ii)使所述工程蓝细菌暴露于光和二氧化碳，其中所述的暴露导致所述工程蓝细 菌将所述二氧化碳转化为正焼姪，其中至少一种所述正焼姪选自由正十H焼、正十四焼、正