的管W在±0.1 mg内计算出细胞团的质量。同时为确定干细胞重量处理细胞， 所述培养物的第二样品被收获、清洗并去湿。得到的细胞团（对应于l-3mg细胞干重）随后 通过在约1ml丙丽加作为抗氧化剂的二下基羟基甲苯炬HT)和内标（如正二十走焼）中縱 润来提取。随后通过离也来团聚细胞碎片而取上清（提取物）做GC分析。为准确定量正 焼姪，使用火焰电离检测（FID)与MS总离子计数相对。使用GC-FID峰面积和正式正焼姪 标准的已知浓度间的校准关系来计算生物提取物中的正焼姪浓度。既然知道提取物体积、 得到的提取物中正焼姪物质的浓度和提取的细胞团的细胞干重，可W确定包含正焼姪的细 胞干重百分数。
[014引本发明中使用的术语"区域"是指生物分子初级结构的物理连续部分。在蛋白质 的情况下，区域被定义为该蛋白质氨基酸序列的连续部分。
[0149] 本发明中使用的术语"域"是指造成生物分子已知的或可能的功能的生物分子结 构。域可W与其区域或部分同延；域也可W包括生物分子的不同的非连续区域。蛋白质域 的例子包括，但不限于，Ig域、胞外域、跨膜结构域和胞质域。
[0150] 本发明中使用的术语"分子"指任何化合物，包括但不限于，小分子、肤、蛋白质、 糖、核巧酸、核酸、脂质等，且该样的化合物可W是天然的或合成的。
[0151] "感兴趣的碳基产物"包括醇类，如己醇、丙醇、异丙醇、下醇、脂肪醇、脂肪酸醋、蜡 醋；姪和焼姪，如丙焼、辛焼、柴油、喷气推进剂8(JP8);聚合物如对苯二酸醋、1,3-丙二醇、 1,4-下二醇、多元醇、聚羟基焼酸醋（PHA)、聚-目-羟基下酸醋（P皿）、丙帰酸醋、己二酸、 e -己内醋、异戊二帰、己内醜胺、橡胶；商品化学品，如乳酸二十二碳六帰酸值HA)的、3-轻 基丙酸醋、Y -戊内醋、赖氨酸醋、丝氨酸、天口冬氨酸醋、天口冬氨酸、山梨醇、抗坏血酸盐、 抗坏血酸、异戊帰醇、羊毛留醇、W-3DHA、番茄红素、衣康酸醋、1,3-下二帰、己帰、丙帰、玻 巧酸醋、巧樣酸醋、巧樣酸、谷氨酸醋、苹果酸醋、3-羟基丙酸（HPA)、乳酸、四氨巧喃、Y -下 内醋、化咯焼丽、轻下酸、谷氨酸、己醜丙酸、丙帰酸、丙二酸；特种化学品，如类胡萝h素、类 异戊二帰、衣康酸；药物和药物中间体，如7-氨基脱己醜氧基头抱菌焼酸（7-ADCA)/头抱菌 素、红霉素、聚丽、抑制素、紫杉醇、多西紫杉醇、聰、肤、类固醇、《-脂肪酸和其他该类感兴 趣的合适产物。该样的产物在生物燃料、工业和特种化学品的情况中有用，作为用于其他产 品如营养补充品、功能食品（neutraceutical)、聚合物、石蜡替代品、个人护理广品和药品 的中间体。
[0152] 生物燃料；生物燃料是指源于生物来源的任何燃料。生物燃料可W指一种或多种 姪、一种或多种醇、一种或多种脂肪醋或其混合物。
[0153] 姪；该术语通常指由碳似元素、氨做元素和可选的氧做元素组成的化合物。 姪基本有H种类型，如芳香姪、饱和姪和不饱和姪如帰姪、快姪和二帰姪。该术语也包括燃 料、生物燃料、塑料、蜡、溶剂和油。姪包括生物燃料，W及塑料、蜡、溶剂和油。
[0154] 除非另外指明，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域 普通技术人员所通常理解的相同的含义。下面描述了示例性的方法和材料，尽管类似或等 同于本发明中描述的方法和材料的方法和材料也可W用于实施本发明且其对本领域技术 人员显而易见。本发明中涉及的所有出版物和其他参考文献整体纳入本发明作为参考。在 冲突的情况下，本发明的说明书（包括定义）优先。材料、方法和实施例仅是示例性的而不 意图是限制性的。
[0巧5] 在全部说明书和权利要求中，单词"包括"或其变型如"包含"或"包括有"应被理 解为指包含指定的成分或成分组，但不排除任何其他成分或成分组。 。巧引 核酸序列
[0157] 焼姪，也被称为石蜡，是仅由碳（C)元素和氨（H)元素组成的化合物（即，姪类）， 其中该些原子毫无例外地被单键连接在一起（即，其为饱和化合物）而没有任何环状结构。 正焼姪是线性的，即非支链的，焼姪。AAR和ADM酶一起起到从醜基-ACP分子合成正焼姪的 作用。
[0158] 因此，本发明提供编码AAR和ADM酶及其变体的基因的分离核酸分子。示例性的 编码AAR基因的全长核酸序列分别如SEQ ID NO ;1、5和13所示，对应的氨基酸序列分别如 SEQ ID N0;2、6、和10所示。示例性的编码ADM基因的全长核酸序列分别如SEQ ID N0;3、 7、和14所示，对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO ;4、8、和12所示。本发明提供的另外的 核酸包括分别编码表1和表2中AAR和ADM酶的任何基因。
[0159] 在一个实施方式中，本发明提供了具有包含编码在感兴趣的宿主细胞中表达的 AAR和ADM及其同源物、变体和衍生物的基因或由该基因组成的核酸序列的分离的核酸分 子。本发明也提供了包含本发明描述的AAR和ADM基因的密码子优化版本（如SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO ;11，其为在聚球藻PCC7002中表达马里纳斯原绿球藻（Prochlorococ州s marinus)MIT 9312的AAR和ADM基因而优化）的序列或由该序列组成的核酸分子。在进一 步的实施方式中，本发明提供了核酸分子及该分子的同源物、变体和衍生物，其包含作为与 野生型基因至少具有76%同一性的AAR或ADM基因的变体序列或由该样的序列组成。核酸 序列可W优选与野生型基因具有80%、85%、90%、95%、98%、99%、99. 9%或甚至更高的 同一'I"生。
[0160] 在另一个实施方式中，本发明的核酸分子编码具有SEQ ID N0;2、4、6、8、10或12 的氨基酸序列的多肤。优选的，本发明的核酸分子编码与SEQ ID NO ;2、4、6、8、10或12具 有至少50%、60、70%、80%、85%、90%或95%同一性的多肤序列，且同一性甚至可^更优 选为 96%、97%、98%、99%、99. 9%或甚至更高。
[0161] 本发明也提供在严格条件下与上述核酸分子杂交的核酸分子，如上面定义和本领 域公知的，严格杂交在低于在特定条件集下特定DNA杂交物的热烙点（Tm)约25C下进行， 其中Tm是50%祀序列与完美匹配的探针杂交的温度。严格清洗在低于特定条件集下特定 DNA杂交物的Tm约5 C的温度下进行。
[0162] 也提供了包含任一个上述核酸序列的片段的核酸分子。该些片段优选包含至少20 个连续的核巧酸。更优选核酸序列的片段包含至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100 或甚至更多的连续核巧酸。
[0163] 本发明的核酸序列片段显示出在多种系统和方法中的用途。例如，该片段可W用 作多种杂交技术中的探针。取决于方法，報核酸序列可W是DNA或RNA。祀核酸序列可W在 杂交前分级（如通过凝胶电泳），或者可W原位对样品进行杂交。本领域技术人员会理解已 知序列的核酸探针在染色体结构确定中（如，通过DNA印迹）或基因表达测量中（如，通过 RNA印迹）具有用途。在该样的实验中，序列片段优选被可检测的标记，W使其与祀序列的 特异性杂交可W被检测和任选地定量。本领域技术人员会理解本发明的核酸片段可W被用 在多种本发明没有特别描述的印迹技术中。
[0164] 也应当理解，当固定在微阵列上时本发明公开的核酸序列片段也有作为探针 的用途。通过将核酸沉积并固定到载体基板上制造微阵列的方法是本领域公知的。在 DNA Microarrays:A Practical Approach(Practical Approach Series), Schena(编 者），0xford University Press(1999)(ISBN:0199637768);Nature Genet.21(1) (suppl) : 1-60 (1999) ；Microarray Biochip:Tools and Technology, Schena(编者），Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division(2000)(ISBN:1881299376)中 综述，其公开整体纳入本发明作为参考。例如，使用包含核酸序列片段，如本发明公 开的核酸序列片段的基因表达分析具有用于细胞和分子生物学领域中的序列片段 的得到确认的用途。固定在微阵列上的序列片段的其他用途在Gerhold等，Trends Biochem.Sci.24:168-173(1999)和 Zweiger,"Trends Biotechnol. 17:429-436(1999); DNA Microarrays:A Practical Approach(Practical Approach Series), Schena(编 者），0xford University Press(1999)(ISBN:0199637768);Nature Genet.21(1) (suppl) : 1-60 (1999) ；Microarray Biochip:Tools and Technology, Schena(编者），Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division(2000) (ISBN:1881299376)中描述， 其中各文献的公开整体纳入本发明作为参考。
[0165] 如本领域公知的，可各种方式测定酶活性。例如0MP的焦磯酸解可W 用分光光度方式追踪（Grubmeyer 等，（1993) J. Biol. Chem. 268:20299-20304)。可 选地，酶活性可W使用色谱技术追踪，如高效液相色谱法（化ung和Sloan, (1986) J.化romatogr. 371:71-81)。作为另一种可选方式，活性可W通过确定酶活性 产生的产物水平而间接测量。该些水平可W使用包括本领域已知和描述的氯 仿 / 甲醇水性提取的技术测定（Cf.M. Kates (1986) Techniques of Lipidology ; Isolation,analysis and identification of Lipids. Elsevier Science Publishers, New化rk(ISBN:0444807322))。更现代的技术包括使用与质谱联合的气 相色谱(Niessen, W. M. A. (2001). Current practice of gas chromatography-mass spectrometry. New York, N.Y:Marcel Dekker. (ISBN:0824704738))。包括液相色质 谱（LCM巧、高效液相色谱（HPLC)、毛细管电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质 谱（MALDI-T0F MS)、核磁共振（NMR)、近红外（NIR)光谱、粘度测定（Knothe，G (1997) Am. Qiem. Soc. Symp. Series, 666:172 - 208)、测定游离脂肪酸的滴定化omers (1997)Fett/ Lipid, 99(2) :52 - 54)、酶学方法、基于物理性质的方法、湿式化学方法等另外的用于识别 重组蛋白质活性和产物的现代技术可W被用于分析本发明生物体产生的产物水平和特性。 如本领域技术人员所知，其他的方法和技术也可能适合于酶活性的测量。
[0166]
[0167] 也提供了载体，包括表达载体，其如本发明中进一步描述的，包含上述的本发明的 核酸分子。在第一实施方式中，载体包括上述分离的核酸分子。在替代的实施方式中，本发 明的载体包括与一种或多种表达控制序列可操作地连接的上述核酸分子。因此本发明的载 体可W用于通过宿主细胞表达促进正焼姪生产活性的AAR和/或ADM多肤。
[016引可用于在原核生物中表达核酸的载体是本领域公知的。
[016引 分离的名化
[0170] 依据本发明另一个方面，提供了由本发明核酸分子编码的分离的多肤（包括突变 蛋白、等位变异体、片段、衍生物和类似物）。在一个实施方式中，分离的多肤包含对应于SEQ ID N0;2、4、6、8、10或12的多肤序列。在本发明的替代实施方式中，分离的多肤包含与SEQ ID N0;2、4、6、8、10或12至少85%相同的多肤序列。优选本发明分离的多肤与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10或12具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、98.1%、98.2%、 98. 3%、98. 4%、98. 5%、98. 6%、98. 7%、98. 8%、98. 9%、99%、99. 1 %、99. 2%、99. 3%、 99. 4%、99. 5%、99. 6%、99. 7%、99. 8%、99. 9%或甚至更高的同一性。
[0171] 依据本发明的其他实施方式，提供了包含上述多肤序列的片段的分离的多肤。该 些片段优选含有至少20个连续氨基酸，更优选至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100 或甚至更多的连续氨基酸。
[0172] 本发明的多肤也包括上述多肤序列与异源多肤间的融合体。异源序列可W，例如， 包括设计W帮助纯化（如组氨酸标签）和/或重组表达的蛋白质的可视化的序列。蛋白融 合体的其他非限制性例子包括允许在瞻菌体或细胞表面上展示编码的蛋白质的融合体，与 本质英光蛋白（如绿色英光蛋白（GFP))的融合体和与IgG化区域的融合体。 引 宿丰细胸转化体
[0174]本发明的另一方面提供了使用本发明的核酸分子或载体转化的宿主细胞及其后 代。在本发明的某些实施方式中，该些细胞携带载体上的本发明的核酸序列，载体可W是但 不必须是自由复制载体。在本发明的其他实施方式中，核酸已被整合入宿主细胞的基因组 中。
[01巧]在优选的实施方式中，宿主细胞包含在宿主细胞中表达AAR或ADM的一个或多个 AAR或ADM编码核酸。
[0176] 在替代的实施方式中，本发明的宿主细胞可W通过本发明的分离核酸的破坏、缺 失或突变进行的重组来突变，W使得相对于缺少突变的宿主细胞，宿主细胞中AAR和/或 ADM蛋白的活性被降低或消除。 阳177] 巧于产牛威兴战的碳某产物的洗择的或工巧化的微牛物
[0178] 微生物：包括古细菌（Archaea)、真细菌炬acteria)和真核生物巧ucarya) H界 中的原核和真核微生物种类，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高级原生生物。 术语"微生物细胞"和"微小生物"可与术语微生物互换使用。
[0179] 多种宿主微生物可W被转化来产生感兴趣的产物。光合自养生物体包括真核植物 和藻类W及原核蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌和紫色非硫细菌。
[0180] 嗜极微生物也被认为是适合的生物体。该样的生物体能承受各种环境参数如温 度、福射、压力、重力、真空、干燥、盐度、pH、氧压和化学物质。其包括在8(TC或高于8(TC 下生长的超嗜热生物如延胡索酸火叶菌（Pyrolobus fumarii);在60-8(TC之间生长的 嗜热生物如灰蓝聚球藻（Synechococ州S lividis);在15-60°C之间生长的中温生物；和 在15C或低于15C下生长的低温生物如嗜冷杆菌（Psyc虹obacter)和某些昆虫。耐福 射生物体包括耐福射奇球菌值einococ州S radio化rans)。耐压生物体包括耐受130Mpa 压力的耐压生物。耐重生物体包括嗜压微生物。耐超重力（如〉Ig)低重力（<lg)生 物也包括在内。耐真空生物体包括缓步动物、昆虫、微生物和种子。耐干燥和低湿休眠 (anhy化obiotic)生物体包括嗜旱生物如团虫（Artemia salina);线虫、微生物、真菌和地 衣。耐盐生物体包括嗜盐生物（如2-5M化C1)盐杆菌科化alobacteriacea)和盐生杜氏 藻值unaliella salina)。耐抑生物体包括嗜碱生物如盐碱杆菌属（化tronobacterium)、 强固芽抱杆菌炬acillus firmus)0F4、螺旋藻属的种（Spirulina spp.)(如抑〉9)和 嗜酸生物如高温红藻（切anidium caldarium)、铁原种属（Ferroplasma)(如低抑）。不 能耐受化的厌氧生物如詹氏甲焼球菌（Methanococcus jannaschii);耐受一定〇2的 微氧生物如梭菌属（Clostridium)和需要化的需氧生物也被包括在内。耐受纯C〇2的 气体耐受生物体包括高温红藻和金属耐受生物体包括耐金属体如嗜酸性铁氧化原始菌 (Ferroplasma acidarmanus)(如铜、铁、神、铜、锋）和青枯菌属（Ralstonia)C册4种（如 锋、钻、铜、隶、铅）。Gross, Michael. Life on the Edge:Amazing Creatures Thriving in Extreme Environments. New YorK:Plenum(1998)和 Seckbach, J. "Search for Life in the Universe with Terrestrial Microbes Which Thrive Under Extreme Conditions. "In Cristiano Batalli Cosmovici, Stuart Bowyer 及 Dan Wertheimer 编牵茸，Astronomical and Biochemical Origins and the Search for Life in the Universe, p. 511. Milan:Editrice Compositori(1997)。
[0181] 植物包括但不限于下列属：拟南芥属（Ar油idopsis)、甜菜属炬eta)、大 豆属（Glycine)、麻风树属（Jatro地a)、芒属（Miscanthus)、泰属（Pani州m)、薦草 属任halaris)、杨属（Populus)、甘藏属（Saccharum)、柳属（Salix)、希蒙得木属 (Simmondsia)和玉蜀泰属狂ea)。
[0182] 藻类和蓝细菌包括但不限于下列属：刺菊石属（Acanthoceras)、Acanthococcus 属、Acaryochloris属、曲壳藻属（Achnanthes)、细曲壳藻属（Achnanthidium)、星状藻属 (Actinastrum)、Actinochlo;ris 属、福环藻属（Actinocyclus)、福射童支藻属 (Actinotaenium)、双金藻属（Amphic虹ysis)、前沟藻属（Amphidinium)、尖粒藻属 (AmphikrAos)、双肋藻属（Amphipleura)、虽形藻属（Amphiprora)、分须藻属 (Am地it虹ix)、双眉藻属（Amphora)、鱼腥藻属（An油aena)、项圈藻属（An油aenopsis)、暗 额藻属（Aneumastus)、纤维藻属（Ankistrodesmus)、销藻属（Ankyra)、异菱藻属 (Anomoeoneis)、虚幻球藻属（Apatococcus)、束丝藻属（Aphanizomenon)、隐球藻属 (Aphanocapsa)、隐毛藻属（Aphanochaete)、隐杆藻属（Aphanothece)、梨囊藻属 (Apio巧stis)、顶丝藻属（Apistonema)、四棘鼓藻属（Art虹odesmus)、节旋藻属 (Artherospira)、Ascochloris 属、星杆藻属（Asterionella)、绿星球藻属 (Asterococcus)、奧杜藻属（Audouinella)、沟链藻属（Aulacoseira)、杆状藻属 (Bacillaria)、己尔比亚藻属化a化iania)