十五焼、正十六焼和正十走焼组成的组，且其中产生的所述正焼姪的量为至少0. 1%细胞干 重和至少为由相同条件下培养的、缺乏所述重组醜基-ACP还原酶和焼酵脱駿单加氧酶而 其它方面相同的蓝细菌产生的量的两倍。
[0045] 2.如第1项的方法，其中至少一种所述重组酶与所述工程蓝细菌异源。
[0046] 3.如第1项的方法，其中所述工程蓝细菌还产生至少一种正帰姪或正焼醇。
[0047] 4.如第3项的方法，其中所述工程蓝细菌产生至少一种选自由正十五帰、正十走 帰和1-十八醇组成的组的正帰姪或正焼醇。
[0048] 5.如第3项的方法，其中所述正焼姪主要包括正十走焼、正十五焼或其组合。
[0049] 6.如第3项的方法，还包括从所述工程蓝细菌或所述培养基中分离至少一种正焼 姪、正帰姪或正焼醇。
[0050] 7.如第1项的方法，其中所述酶由质粒编码。
[0051] 8.如第1项的方法，其中所述酶由整合入所述工程蓝细菌的基因组中的重组基因 编码。
[0052] 9.如第1项的方法，其中所述酶由W多个拷贝在所述工程蓝细菌中存在的基因编 码。
[005引10.如第1项的方法，其中所述酶由作为操纵子的部分的基因编码，而且其中所述 基因的表达由单一启动子控制。
[0054] 11.如第1-10项中任一项的方法，其中至少95%的所述正焼姪是正十五焼和正 十走焼。
[00巧]12.如第1-10项中任一项的方法，其中所述醜基-ACP还原酶和焼酵脱駿单加氧酶 分别与SEQ ID NO ;6和SEQ ID NO ;8至少95%相同。
[0056] 13.如第12项的方法，其中所述工程蓝细菌产生正十五焼和正十走焼，且其中正 十五焼相对于正十五焼加正十走焼的质量百分比至少为20%。
[0057] 14.如第12项的方法，其中所述工程蓝细菌产生正十五焼和正十走焼，且其中正 十五焼相对于正十五焼加正十走焼的质量百分比小于30%。
[0058] 15.如第12项的方法，其中所述工程蓝细菌产生正十五焼和正十走焼，且其中正 十五焼相对于正十五焼加正十走焼的质量百分比在20%到30%之间。
[0059] 16.如第1-10项中任一项的方法，其中所述醜基-ACP还原酶和焼酵脱駿单加氧酶 分别与SEQ ID NO ;10和SEQ ID NO ;12至少95%相同。
[0060] 17.如第16项的方法，其中所述工程蓝细菌产生正十五焼和正十走焼，且其中正 十五焼相对于正十五焼加正十走焼的质量百分比至少为50%。
[0061] 18.如第16项的方法，其中所述工程蓝细菌产生正十五焼和正十走焼，且其中正 十五焼相对于正十五焼加正十走焼的质量百分比小于60%。
[0062] 19.如第16项的方法，其中所述工程蓝细菌产生正十五焼和正十走焼，且其中正 十五焼相对于正十五焼加正十走焼的质量百分比在50%到60%之间。
[0063] 20.如第1-10项中任一项的方法，其中所述酶由作为操纵子的部分的基因编码， 而且其中所述基因的表达由一个或多个诱导型启动子控制。
[0064] 21.如第20项的方法，其中至少一个启动子是尿素抑制、硝酸盐诱导的启动子。
[006引 22.如第21项的方法，其中所述启动子是nirA型启动子。
[0066] 23.如第22项的方法，其中所述nirA型启动子是P(nir07)。
[0067] 24.如第1-10项中任一项的方法，其中所述重组醜基-ACP还原酶和焼酵脱駿单加 氧酶分别与569 10側；27和569 10側；29至少95%相同。
[0068] 25.如第1-10项中任一项的方法，其中所述工程蓝细菌包括至少两个编码不同的 ADM和醜基-ACP还原酶的操纵子。
[0069] 26.如第25项的方法，其中至少一个操纵子编码分别与SEQ ID NO ;27和SEQ ID NO ;29至少95%相同的醜基-ACP还原酶和焼酵脱駿单加氧酶。
[0070] 27.如第25项的方法，其中至少一个操纵子编码分别与SEQ ID NO ;10和SEQ ID NO ; 12至少95%相同的醜基-ACP还原酶和焼酵脱駿单加氧酶。
[0071] 28.如第8项的方法，其中所述醜基-ACP还原酶和焼酵脱駿单加氧酶分别与SEQ ID NO ; 10 和 SEQ ID NO ; 12 至少 95 %相同。
[0072] 29.如第28项的方法，其中所述醜基-ACP还原酶和焼酵脱駿单加氧酶的表达由诱 导型启动子控制。
[0073] 30.如第29项的方法，其中所述工程蓝细菌在诱导物的存在下产生至少0. 5%的 DCW正焼姪，和其中所述正焼姪包括正十五焼和正十走焼，而且其中正十五焼相对于正十五 焼加正十走焼的质量百分比至少为50%。
[0074] 31.如第29项的方法，其中所述工程蓝细菌还包括编码分别与SEQ ID NO ;27和 SEQ ID NO ;29至少95%相同的醜基-ACP还原酶和焼酵脱駿单加氧酶的第二操纵子。
[00巧]32.如第31项的方法，其中所述工程蓝细菌在诱导物的存在下产生正焼姪，和其 中至少95%的所述正焼姪是正十五焼和正十走焼，而且其中正十五焼相对于正十五焼加正 十走焼的质量百分比至少为80%。
[0076] 33. -种工程蓝细菌，其中所述工程蓝细菌包含一个或多个编码醜基-ACP还原 酶、401酶或该两种酶的重组基因，其中所述醜基-4〔？还原酶与569 10^;27至少95%相 同且其中所述焼酵脱駿单加氧酶与SEQ ID NO ;29至少95%相同。
[0077] 34. -种工程蓝细菌，其中所述工程蓝细菌包含一个或多个编码醜基-ACP还原 酶、焼酵脱駿单加氧酶或该两种酶的重组基因，其中至少一种所述重组基因在硝酸盐诱导 启动子的控制之下。
[0078] 35. -个重组基因，其中所述基因包含控制所述基因的表达的启动子，其中所述启 动子包含与SEQ ID NO ;24相同的连续核酸序列。
[0079] 36.包含启动子的分离的DM分子，其中所述启动子包含与SEQ ID NO ;24相同的 连续核酸序列。
[0080] 附图简要说明
[00引]图1描述了，A图面中，基于（l)AAR酶（如和（2)ADM酶（如tlll31：3) 顺序活性产生正焼姪的酶途径；B图面中，经由醜基-CoA的正焼酵生物合成。醜基-CoA通 常为脂肪酸降解的中间体；C图面中，通过醜基-ACP的正焼酵生物合成。醜基-ACP通常是 脂肪酸生物合成的中间体。注意H种不同类型的ACP还原酶；（i)目-丽醜基-ACP还原酶、 扣）帰醜基-ACP还原酶和（iU)醜基-ACP还原酶。醜基-ACP还原酶（一种新酶）生成 焼酵脱駿单加氧酶的底物。CoA;辅酶A，ACP;醜基载体蛋白；D图面中，替代的醜基-CoA介 导的焼姪生物合成途径。见本文实施例1中的其它讨论。
[0082] 图2描述了 JCC9a和JCC1076细胞团BHT(下基羟基甲苯）-丙丽提取物的0到 2700000计数的总离子色谱，W及正焼姪和正-1-焼醇正式标准。方法1指定的峰W常规字 体显示，方法2指定的峰W斜体显示。
[0083] 图3描述了由方法1指定的JCC1076峰MS裂解谱（各图面的上部质谱），相对于 其各自的NIST库命中的发现绘图（各图面的下部质谱）。A，正十五焼；B，1-十四醇；C，正 十走焼；D，1-十六醇。
[0084] 图4A描述了 JCC1113和JCC1114细胞团BHT-丙丽提取物的0到7500000计数的 总离子色谱，W及C13-C2。的正焼姪和C 14、Cie和C 18的正-1-焼醇正式标准。图4B，描述了 JCC1113和JCC1114细胞团BHT-丙丽提取物的0到720000计数的总离子色谱，W及4A中 提及的正焼姪和正焼醇的正式标准。
[00财图5描述了由方法1指定的JCC1113峰的MS裂解谱（各图面的上部质谱），相对 于其各自的NIST库发现绘制（各图面的下部质谱）。A，正十H焼；B，正十四焼；C，正十五 焼；D，正十六焼；E，正十走焼；F，1-十六醇。
[0086] 图6描述了 JCC1170和JCC1169细胞团BHT-丙丽提取物的0到6100000计数的 总离子色谱，相对于对照株JCC1113和JCC1114的总离子色谱。JCC1169中没有观察到姪产 物。JCC1170中的未识别峰可能是顺式-11-十八帰酵。
[0087] 图7描述了由方法1指定的JCC1170峰的MS裂解谱（各图面的上部质谱），相对 于其各自的NIST库发现绘制（各图面的下部质谱）。A，1-十四醇；B，1-十六醇。
[0088] 图 8A 描述了 JCC1221、JCC1220、JCClieOb、JCClieOa、JCC1160 和 JCC879 细胞团 BHT-丙丽提取物的0到75000000计数的总离子色谱，W及C13-C2。的正焼姪和C i4、Cie和C 18 的正焼醇正式标准。18分钟左右的双峰分别对应十九-二-帰和1-十九帰（数据未显示） (由JCC138自然产生的正帰姪）；图8B描述了 JCC1221和JCC879细胞团BHT-丙丽提取物 的0到2250000计数的总离子色谱，W及8A中提及的正焼姪和正焼醇的正式标准。
[0089] 图9描述了由方法1指定的JCC1221峰的MS裂解谱（各图面的上部质谱），相对 于其各自的NIST库发现绘制（各图面的下部质谱）。A，正十H焼；B，正十四焼；C，正十五 焼；D，正十六焼；E，正十走焼；F，1-十八醇。
[0090] 图10描述了 JCC1221中随壮观霉素浓度变化的细胞内正焼姪产量。
[0091] 图11描述了 JCC1281细胞团BHT-丙丽提取物的0到1080000计数的总离子色谱， 相比于对照株JCC138的总离子色谱，W及正式标准正焼姪的总离子色谱。
[009引图12描述了由方法1指定的JCC1281峰的MS裂解谱（各图面的上部质谱），相对 于其各自的NIST库发现绘制（各图面的下部质谱）。A，正十五焼；B，正十走焼。
[0093] 图13描述了由方法1指定的JCC3峰MS裂解谱（各图面的上部质谱），相对于其 各自的NIST库发现绘制（各图面的下部质谱）。A，正十五焼；B，正十六焼；C.正十走焼。
[0094] 图14描述了与对照株JCC1084相比，JCC1084t中增强的细胞内正焼姪产生。误 差棒代表了 3个独立观察的标准差。
[0095] 图15描述了 JCC1113和JCC1221细胞团BHT-丙丽提取物的0到31500000计数 的总离子色谱，W及正式标准正焼姪。
[0096] 详细说明
[0097] 除非本发明中另有限定，关于本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技 术人员通常理解的含义。此外，除非上下文需要，单数术语应该包含复数而复数术语应当包 含单数。通常，本发明中描述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学及蛋 白质和核酸化学作用和杂交学相关使用的术语和其技术是本领域众所周知并常用的。
[0098] 除非另有注明，本发明的方法和技术通常依据本领域公知的常规方法和按 本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中描述的进行。参见， 女口 Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ；Ausubel 等,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992 和 2002 增刊）； Harlow 和 Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) ；Taylor 和 Drickamer, Introduction to Glycobiology,Oxford Univ. Press (2003) ;Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp. ,Freehold, N. J. ；Handbook of Biochemistry:Section A Proteins, Vol I, CRC Press (1976) ；Handbook of Biochemistry:Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976) ；Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)〇
[0099] 本发明中涉及的所有出版物、专利和其他参考文献在此被整体纳入作为参考。
[0100] 下列术语，除非另有说明，应当被理解为具有下列含义：
[0101] 术语"多核巧酸"或"核酸分子"是指至少10个碱基长度的核巧酸聚合形式。该术 语包括DNA分子（如cDNA或基因组的或合成的DNA)和RNA分子（如mRNA或合成的RNA)， W及包含非天然核巧酸类似物、非原始核巧间键（intemucleoside bond)或两者的DNA或 RNA类似物。核酸可W是任何拓扑构象。例如，核酸可W是单链的、双链的、H链的、四重体 的、部分双链的、分枝的、发夹的、环形的或是扣锁构象的。
[010引除非另有说明，且作为通常为"SEQ ID NO:"的形式的本发明描述的所有序列的 例子，"包含SEQ ID NO ;1的核酸"是指其至少一部分具有（i)SEQ ID NO ;1的序列，或（ii) 与SEQ ID NO ;1互补的序列的核酸。该两者间的选择由上下文决定。例如，如果该核酸被 用作探针，该两者间的选择由探针与所希望的祀互补的需要决定。
[0103]"分离"的RNA、DNA或混合聚合物是基本上与天然宿主细胞中与该天然多核巧酸自 然伴随的其他细胞成分（如与其自然相关的核糖体、聚合酶W及基因组序列）分离的RNA、 DNA或混合聚合物。
[0104] 本发明中使用的，"分离的"有机分子（如焼姪、帰姪或焼酵）是基本上与其所来源 的宿主细胞的细胞成分（如膜脂质、染色体、蛋白质），或与宿主细胞在其中培养的培养基 分离的有机分子。尽管特定的分离的生物分子可W被纯化至接近均质，但该术语不要求生 物分子与所有其他化学物质分离。
[0105] 术语"重组的"是指（1)已从其自然发生的环境中移除，（2)不与自然发现的该基 因中的多核巧酸的所有或部分相关联，（3)与其非自然关连的多核巧酸可操作地连接，或 (4)不自然存在的生物分子，如基因或蛋白质。术语"重组的"可用于指克隆的DNA分离物、 化学合成的多核巧酸类似物、或通过源源系统生物合成的多核巧酸类似物，W及用于指由 该类核酸编码的蛋白质和/或mRNAso
[0106] 如本发明中使用的，如果异源序列被置于与内源核酸序列相邻W使该内源核酸序 列的表达被改变，则生物体基因组中的该内源核酸序列（或该序列编码的蛋白质产物）本 发明中被认为是"重组的"。在该情况下，异源序列是非天然与内源核酸序列相邻的序列，无 论该异源序列其本身是否是内源（源自相同的宿主细胞或其后代）或外源的（源自不同的 宿主细胞或其后代）。举例来说，启动子序列可W置换（例如通过同源重组）宿主细胞基因 组中基因的天然启动子，W使该基因具有改变的表达模式。因为其至少与一部分自然位于 其侧面的序列分离，该基因现变为"重组的"。
[0107] 如果核酸包含任何对于基因组中的相应核酸非自然发生的修饰，则该核酸也被认 为是"重组的"。例如，如果其包含人为导入（如通过人为干预）的插入、缺失或点突变，贝U 内源编码序列被认为是"重组的"。"重组的核酸"也包括在异源位点整合入宿主细胞染色 体中的核酸W及作为附加体存在的核酸构建体。
[010引本发明中使用的，短语参考核酸序列的"简并变体"包括可W依据标准遗传密码翻 译W提供与从参考核酸序列翻译的相同的氨基酸序列的核酸序列。术语"简并寡核巧酸"或 "简并引物"用于表示能够与祀核酸序列杂交的寡核巧酸，该祀核酸序列不必要在序列上相 同但在一个或多个特定片段内相互同源。
[0109] 涉及核酸序列的术语"序列同一性百分数"或"相同"是指当W最大对应性比对 时相同的两个序列中的残基。序列同一性比较的长度可W覆盖至少约9个核巧酸的延伸， 通常至少约20个核巧酸，更经常至少约24个核巧酸，通常至少约28个核巧酸，更通常至 少约32个核巧酸，且优选至少36个或更多的核巧酸。本领域中有多种已知的不同算法 可用于测定核巧酸序列同一'I"生。例如，可W使用Wisconsin Package版本10. 0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis 的程序 FASTA、Gap 或 Beatfit 来比较多核巧酸序列。 FASTA提供查询和检索序列间最佳重叠区域的比对和序列同一'f生百分数。Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98(1990)(在此通过引用整体纳入本发明）。例如，核酸序列间的同一 性百分数可W FASTA W其默认参数化的字段大小和用于得分矩阵的N0PAM因子），或使 用GCG版本6.1(纳入作为参考）中提供的Gap W其默认参数来确定。可选择地，可W使 用计算机程序 BLAST 来比较序列（Altschul 等，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990) ;Gish 和 States,化1:脚6 Genet. 3:266-272(1993) ;Madden 等，Meth.Elnzymol. 266:131-141 (1996); Altschul 等，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997) ;Zhang 和 Madden, Genome Res. 7:649-656(1997))，特别是 blas1:p 或忧 lastn(Altschul 等，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))。
[0110] 术语"基本同源性"或"基本相似性"当指核酸或其片段时，表示在W适合的核巧 酸插入或缺失与另一核酸（或其互补链）最佳比对时，W上面讨论的任何序列同一性的公 知算法如FASTA、BLAST或Gap计算的，在至少约76 %、80 %、85 %，优选至少约90 %，更优选 至少约95 %、96 %、97 %、98 %或99 %核巧酸碱基中存在核巧酸序列同一性。
[0111] 或者，当核酸或其片段与另一核酸、与另一核酸的链或与其互补链在严格杂交条 件下杂交时，存在基本同源性或相似性。核酸杂交试验情况中的"严格杂交条件"和"严格 清洗条件"取决于多种不同的物理参数。如本领域技术人员容易理解的，核酸杂交会受到如 盐浓度、温度、溶剂、杂交种类的碱基组成、互补区域长度和杂交核酸之间核巧酸碱基的失 配数目的该些条件的影响。具备本领域常识的人知道怎样改变该些参数W实现特定的杂交 严格性。
[0112] 通常，"严格杂交"在低于特定条件组合下特异DNA杂交物的热烙点（Tm)约25C 下进行。"严格清洗"在低于特定条件组合下特异DNA杂交物的Tm约5C的温度下进行。Tm 是50 %的祀序列与完全匹配的探针杂交的温度。见Sambrook等