磁性纳米颗粒介导igf-ⅰ基因转染的脂肪干细胞及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及关节软骨损伤修复领域，尤其涉及一种磁性纳米颗粒介导IGF- I基 因转染的脂肪干细胞及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 关节软骨损伤作为一个基本的病理过程，几乎参与了所有临床常见的关节疾病病 理变化早期阶段，如创伤性关节炎，类风湿性关节炎，股骨头坏死等。该些关节疾病虽然有 着完全不同的病因和各异的病理变化过程，但在其病变早期都表现出相同的病理过程，即 关节软骨的病变。如何能够在关节疾病病变早期控制软骨的损伤程度，尽早终止软骨进一 步损伤，甚至完全磨损，尽早干预并促进软骨组织的修复，是治疗此类关节疾病的关键所 在。然而，由于软骨组织内缺乏血管和淋己分布，软骨细胞含量少，缺乏细胞分化所必须的 祖母细胞且包埋于稠厚的细胞外基质中，缺乏迁徙能力，无法移动到损伤部位参与修复，因 此其自我修复能力非常差，即使是微小的软骨缺损也难W自然修复。
[0003] 目前临床上对于关节软骨损伤主要W手术治疗为主，包括：关节镜修复术、微骨折 术、自体软骨移植术和自体软骨细胞移植术等。但是该些治疗方法临床疗效不够理想，且存 在许多不足之处。其中关节镜修复术短期疗效较明显，但仅能延缓软骨磨损进程，无法促进 软骨缺损修复，无法最终阻止关节炎的发生。微骨折术由于缺乏精确有效的定位和调控，且 修复后形成的是W纤维软骨为主的混合组织，因此临床效果并不理想。自体软骨移植术和 自体软骨细胞移植术目前临床较为常用，但存在着取材来源有限，供区感染、伤口难愈合， 患者需遭受额外痛苦且不易接受等诸多问题。由于对关节软骨损伤缺乏有效的临床治疗方 法，许多患者最后都进一步发展成为骨性关节炎，而作为临床治疗骨性关节炎唯一有效的 人工关节置换术，其费用高昂，创伤大，并发症多，使用寿命有限，患者需遭受极大的身也痛 苦和沉重的经济负担。由于此类关节疾病发病率高，致残性高，严重损害了患者的身体健 康，危害巨大，因此被世界卫生组织定义为"第一致残疾病"。
[0004] 组织工程技术的出现，为关节软骨损伤的治疗提供了一种全新的思路和方法。美 国国家科学基金会于1987年首次提出了"组织工程"（tissue engineering)的概念，其基 本原理是应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损 组织或器官的结构、功能的生物活性替代物。由于软骨组织中细胞成分单一，结构简单，只 含有软骨细胞，因此组织工程技术非常适用于软骨缺损修复的研究。1977年，Green成功分 离培养软骨细胞，并尝试与脱巧骨支架材料联合培养，为软骨组织工程研究的发展奠定了 基础。1994年Vacanti等用分离的牛关节软骨细胞与可降解的生物材料在裸鼠皮下成功构 建出透明软骨组织，此后软骨组织工程进入了快速发展阶段，我国科学家曹谊林等于1997 年在裸鼠体内成功构建出具有皮肤覆盖的复杂H维空间结构的人耳廓形态软骨，标志着软 骨组织工程研究迈向了一个新的台阶。此后，软骨组织工程技术迅速发展，成为了近十年来 的研究热点。作为一口新兴的交叉学科，软骨组织工程的发展具有非常广阔的前景。
[0005] 软骨组织工程的研究内容主要包括H个方面：支架材料、种子细胞和细胞因子。其 中支架材料为种子细胞提供获取营养、气体交换、废物排泄和生长代谢的场所，种子细胞附 着于支架材料上不断更新、代谢，分化繁殖新的细胞，细胞因子参与调控种子细胞代谢，促 进细胞增殖、分化等，最终形成与正常软骨组织在形态和功能上完全一致且能正常代谢、增 殖的新生软骨组织，从而达到治愈关节疾病的目的。目前，软骨组织工程研究的焦点主要集 中在W下几个方面：H维生物支架材料的开发与研究，种子细胞的筛选和培养途径，干细胞 归巢率的提高，各种细胞因子对种子细胞代谢、增殖的影响及其调控等。
[0006] 目前软骨组织工程常用种子细胞包括软骨细胞和干细胞。骨髓间充质干细胞 化one mesenchymal stem cells, BMSCs)是最早被研究的成体干细胞，可向骨组织、软骨 组织、肌肉组织及神经组织等多种组织定向分化。但其取材创伤大，并发症多，且骨髓中含 量低的特点限制了 BMSCs的广泛应用，之后有学者从皮肤、肌肉、肝脏及滑膜等组织中均分 离出与BMSCs具有类似生物学特性的间充质干细胞，也具有多向分化的能力。2001年日本 学者Zuk从人体抽出的脂肪中获得了同样具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，称 之为脂肪干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs)。Ugarte 等研究发现，ADSCs 与 BMSCs在细胞形态、生长动力学、细胞衰老性、表面标志、多向分化潜能W及外源基因的导入 效率等方面没有明显区别。而且ADSCs能在多代培养后保持染色体核型和端粒转移酶活性 不变；其在转化生长因子的诱导下可向软骨组织细胞分化，相比较而言，ADSCs具有W下优 点：1.取材方便，创伤小，并发症少，病人易于接受；2.分离培养简单，容易获得；3来源充 足，每Ig脂肪组织可W获得5 X 103干细胞，是Ig骨髓组织获得干细胞的300倍。
[0007] 细胞因子在ADSCs定向分化为软骨细胞的过程中起到了非常关键的作用。膜岛 素样生长因子-1 (Insulin-1化e growth化ctor- I，IGF- I )能够促进软骨细胞增殖、 再分化，保持软骨细胞的特异表型并抑制程序性调亡，同时促进软骨基质合成代谢，抑制软 骨基质的降解，是体内调节软骨蛋白聚糖合成最重要的生长因子。在软骨细胞体外培养中， IFG- I能够增加蛋白聚糖的合成，使软骨蛋白聚糖的合成量达到与体内相当的水平。有研 究表明IFG- I能够诱导体外培养的ADSCs分化为软骨细胞。但外源性IGF- I价格昂贵， 稳定性不好，体内半衰期短，生物膜透过性差，且在游离状态下极易失活，从而限制了其有 效性的发挥。应用基因转染技术使ADSCs自行大量分泌、表达特定的细胞因子，可W有效的 促进ADSCs向软骨细胞分化，并且避免了免疫排斥反应等安全问题。近年来迅速成为了研 究热点。而在基因转染技术中，安全且高效的基因转染载体是转染成功的关键。目前常用 的基因转染载体主要分为病毒型和非病毒型，病毒型载体转染效率较高，但其潜在的致瘤 性、装载容量有限和费用高等问题限制了其临床应用。非病毒型载体转染效率有待提高，但 由于其可靠的生物安全性，近年来日趋受到关注。
[0008] 干细胞归巢是指自体或外源性干细胞在多种因素的作用下趋向性迁移并定植到 祀向组织参与组织修复的过程。目前的移植方式主要包括经静脉、经动脉和患处局部移植。 近年来，随着干细胞治疗学的兴起，对于干细胞归巢的研究迅速升温。
[0009] 然而，目前研究显示祀向组织中植入干细胞的归巢率非常低，疗效有限，极大地 影响了干细胞归巢技术在组织工程学中的应用。其主要的原因是难W确保足够数量的干细 胞归巢定植至祀组织中。Barbash等对体外培养的BMSCs向梗死也肌的迁移归巢研究表明， 在各时间段梗死也脏对MSCs的摄取率都低于1%，使得干细胞归巢的疗效大大降低。因此， 如何促进和提高干细胞归巢率已成为干细胞治疗疾病的关键。
[0010] 当将搭载有IGF- I及种子细胞的复合支架植入动物模型体内时，由于极低的干 细胞归巢率，再加上动物模型的日常活动及模型体内支架处的血液、关节液的流动，使得负 载在支架内的祀细胞及细胞因子无法长期有效的聚集、增殖，严重影响了缺损软骨的正常 修复速度和程度。如何通过适当有效的方法促进和提高干细胞归巢率，使干细胞牢固定位 于特定损伤部位，并且维持细胞因子持续、高效释放W促进干细胞快速、稳定的定向分化、 增殖和维持细胞表型，从而使损伤软骨尽早再生就成为了软骨组织工程学的关键所在。
[0011] 磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles，MNPs)及W其为载体的基因转染技术 的出现为解决W上问题提供了新的思路。MNPs是一类智能型的纳米磁性材料，属于非病毒 型载体，研究表明MNPs能显著提高基因转染效率，且具有良好的生物相容性，对多种干细 胞均无毒性，且对干细胞的表型、分化潜能无影响。MNPs既具有纳米材料的特质如粒径小、 比表面积大、能被细胞吞瞻等，又同时具有超顺磁性，能够响应磁场祀向应力，从而可W人 为控制其在特定组织和细胞内的聚集和定位，并能作为标记探针实现对干细胞在体内的定 位追踪。W MNPs为载体的基因转染技术既能够大幅提高转染效率，也能够借助MNPs的磁 场祀向响应力特性极大地提高干细胞归巢率，同时又能作为标记物W追踪确认干细胞在体 内的迁移情况。在软骨组织工程领域具有广阔的发展和应用前景。
【发明内容】
[0012] 为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种磁性纳米颗粒介导IGF- I 基因转染脂肪干细胞的方法，具有安全无害、祀向性高、目的基因高效稳定表达等优点，能 大幅度提高基因转染效率，并能借助磁共振技术实现对干细胞在体内的定位追踪。本发明 的另外一个目的是提供采用上述的方法获