，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)，9. 51页，如此纳入作为参考。出于本发明的目的，"严格条件"对于溶液 相杂交定义为在6xSSC(其中20xSSC含有3. 0M化C1和0. 3M巧樣酸轴）中，1%SDS，65°C 下进行水相杂交（即，没有甲醜胺）8-12小时，随后进行两次在0. 2xSSC中，0. 1 % SDS，65C 下的清洗20分钟。技术人员可W理解在65C下的杂交会W取决于包括杂交序列长度和同 一性百分数的多个因素的不同速率发生。
[011引本发明的核酸（也被称为多核巧酸）可W包括RNA、cDNA、基因组DNA和上述 核酸的合成形式与混合聚合体的有义链和反义链。如本领域技术人员容易理解的，它们 可W被化学和生物化学地修饰，或可W包含非天然的或衍生的核巧酸碱基。该样的修饰 包括，例如，标记、甲基化、一个或多个天然存在的核巧酸被类似物替换、核巧酸间修饰 (intemucleotide modification)如不带电连接（如甲基麟酸醋、磯酸H醋、氨基磯酸醋、 氨基甲酸醋等）、带电的连接（如硫代磯酸醋、二硫代磯酸醋等）、侧部分（如多肤等）、嵌入 剂（如吓巧、补骨脂素等）、馨合剂、焼化剂和修饰的连接（如，a端基异构核酸等）。也包 括模拟多核巧酸通过氨键和其他化学相互作用结合指定序列的能力的合成分子。该样的分 子是本领域已知的且包括，例如，在分子骨架中肤键替代磯醋键的分子。其他修饰可包括， 例如其中核糖环包含桥接部分或其他结构如在"锁"核酸中发现的修饰的类似物。
[0114] 当用于核酸序列时，术语"突变的"意思是与参考核酸序列相比，核酸序列中的 核巧酸可W被插入、缺失或改变。可W在基因座上进行单一改变（点突变）或在单个基 因座上插入、缺失或改变多个核巧酸。此外，可W在核酸序列内的任意数目的基因座上进 行一个或多个改变。核酸序列可W用任何本领域已知的方法突变，包括但不限于诱变技 术如"易错PCR"(在DNA聚合酶的复制保真度低的条件下进行PCR W使得沿PCR产物的 全长获得高点突变率的过程，见Leung等，Technique, 1:11-15(1989) W及Caldwell和 化yce，PCR Methods Applic. 2:28-33(1992));和"寡核巧酸定点诱变"（能够在任何感兴 趣的克隆DNA片段中产生点特异性突变的过程；见，如Rei化aar-Olson和Sauer, Science 241:53-57(1988))。
[0115] 本发明使用的术语"衰减"通常指功能缺失，包括对基因序列或控制基因序列转录 的序列进行的突变、部分或全部缺失、插入、或其他变化，其降低或抑制基因产物的产生，或 产生出非功能性的基因产物。在某些情况下功能缺失被描述为敲除突变。衰减也包括通过 改变核酸序列的氨基酸序列变化、将基因置于较不活跃的启动子控制之下、下调、表达指向 感兴趣的基因的干扰RNA、核酶或反义序列或通过任何其他本领域已知的技术。在一个实例 中，特定酶对于反馈抑制或非产物或反应物的组合物引起的抑制（非途径特异性反馈）的 敏感性较低，W使得酶活性不受化合物存在的影响。在其他情况下，已被改变为较低活性的 酶可W被称为衰减的。
[0116] 缺失；从核酸分子中去除一个或多个核巧酸或从蛋白质中去除一个或多个氨基 酸，从而两侧的区域连接在一起。
[0117] 敲除；表达水平或活性被降低至零的基因。在某些实例中，基因通过其编码序列的 部分或全部的缺失被敲除。在其他实例中，基因通过向其开放阅读框中引入一个或多个核 巧酸（其导致无义的或另外非功能性蛋白质产物的翻译）被敲除。
[0118] 本发明中使用的术语"载体"意图指能够转运其已连接的另一核酸的核酸分子。载 体的一种类型是"质粒"，其通常是指环形双链DNA环，另外的DNA片段可W接合到其中，但 也包括线性双链分子如由聚合酶链式反应（PCR)扩增得到的或从用限制性内切酶处理环 形质粒得到的线性双链分子。其他载体包括粘粒、细菌人工染色体炬AC)和酵母人工染色 体（YAC)。另外一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可W被接合到病毒基因组 中（下面更详细地讨论）。特定载体能够在其被引入的宿主细胞内自主复制（如，具有在宿 主细胞内起作用的复制起点的载体）。其他载体在被引入宿主细胞中时可W被整合进宿主 细胞的基因组中，并由此随宿主基因组一起复制。此外，特定的优选载体能够引导其可操作 地连接的基因的表达。该样的载体本发明中被称为"重组表达载体"（或简称"表达载体"）
[0119] "可运行地连接的"或"可操作地连接的"表达控制序列是指其中表达控制序列与 感兴趣的基因连续的连接W控制感兴趣的基因，W及W反式方式或在一定距离起作用W控 制感兴趣的基因的表达控制序列。
[0120] 本发明中使用的术语"表达控制序列"是指影响与之可操作连接的编码序列的表 达所必须的多核巧酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序 列。表达控制序列包括适合的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效的RNA加工信号 如剪接和多腺巧酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列（如，核糖体结合 位点）；提高蛋白质稳定性的序列；和当需要时，增加蛋白质分泌的序列。该样的控制序列 的性质依宿主生物体的不同而不同；在原核生物中，该样的控制序列通常包括启动子、核糖 体结合位点和转录终止序列。术语"控制序列"意图包括，最少其存在对于表达至关重要的 所有组分，且也可W包括其存在有利的其他组分，例如前导序列和融合伴体序列。
[0121] 本发明中使用的术语"重组宿主细胞"（或简称"宿主细胞"）意指重组载体被引入 的细胞。应当理解该样的术语不仅是指特定对象细胞，也指该样细胞的后代。由于突变或 环境影响可能导致后续世代中发生特定的改变，该样的后代可能实际上不与母细胞相同， 但仍然包含在本发明使用的术语"宿主细胞"的范围内。重组宿主细胞可W是培养中的分 离的细胞或细胞系，或可W是定殖于活组织或生物体中的细胞。
[0122] 本发明中使用的术语"肤"是指短的多肤，如通常低于50个氨基酸长度和更通常 低于30个氨基酸长度的多肤。本发明中使用的术语包括类似物和模拟结构和由此模拟生 物功能的模拟物。
[0123] 术语"多肤"包括自然发生的和非自然发生的蛋白质及其片段、突变体、衍生物和 类似物。多肤可W是单体的或聚合的。此外，多肤可W包括多个不同的结构域，各结构域有 一种或多种不同的活性。
[0124] 术语"分离的蛋白质"或"分离的多肤"是就其衍生的起源或来源来说（1)不与在 其原始状态中伴随的天然相关的组分结合，（2) W自然中不存在的纯度存在，其中纯度可W 相对于其他细胞物质的存在来判定（如，不含来自相同种的其他蛋白质），（3)由来自不同 物种的细胞表达，或（4)不是自然发生的（如其是自然发现的多肤的片段，或其包含自然中 不存在的氨基酸类似物或衍生物或不同于标准肤键的连接）。因此，化学合成的或在不同于 其天然来源细胞的细胞系统中合成的多肤将与其自然相关的组分"分离"。多肤或蛋白质也 可W通过使用本领域公知的蛋白质纯化技术分离而使得基本没有天然相关的组分。如此定 义的，"分离的"不必须是需要该样描述的蛋白质、多肤、肤或寡肤已从其原始环境中物理移 除。
[0125] 本发明中使用的术语"多肤片段"是指与全长的多肤相比具有缺失，如氨基端和/ 或駿基端缺失的多肤。在优选的实施方式中，多肤片段是其中片段的氨基酸序列与自然发 生序列中的对应位置相同的连续序列。片段通常为至少5、6、7、8、9或10个氨基酸长，优选 至少12、14、16或18个氨基酸长，更优选至少20个氨基酸长，更优选至少25、30、35、40或 45个氨基酸长，甚至更优选至少50或60个氨基酸长，甚至更优选至少70个氨基酸长。
[0126] "修饰的衍生物"是指初级结构序列基本同源，但包括例如体内或体外化学或生物 化学修饰或整合了天然多肤中不存在的氨基酸的多肤或其片段。如本领域技术人员容易 理解的，该样的修饰包括，例如己醜化、駿化、磯酸化、糖基化、泛素化、标记（如用放射性核 素）W及各种酶修饰。多种标记多肤的方法和多种用于该样目的的取代物或标记是本领域 公知的，并包括放射性同位素如i 25I、32P、35S和巧、连接到标记的抗配体物（antiligand)(如 抗体）上的配体、英光团、化学发光剂、酶及可W作为标记配体的特异性结合对成员的抗配 体物。标记的选择取决于需要的灵敏度、与引物偶联的难易、稳定性要求和可用的手段。 标记多肤的方法是本领域公知的，参见如Ausubel等，Qirrent Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992 和 2002 增刊）（在此纳入作为参考）。
[0127] 术语"融合蛋白"是指包含与异源氨基酸序列偶联的多肤或片段的多肤。融合蛋 白是有用的，因为它们可W被构建为包含来自两个或更多个不同蛋白质的两个或更多想要 的功能元件。融合蛋白包含来自感兴趣的多肤的至少10个连续氨基酸，更优选至少20或 30个氨基酸，甚至更优选至少40、50或60个氨基酸，还更优选至少75、100或125个氨基 酸。包括本发明蛋白质整体的融合体有特别的用途。包括在本发明融合蛋白中的异源多肤 至少6个氨基酸长，经常至少8个氨基酸长，并有利地至少15、20、和25个氨基酸长。包括 更大的多肤（如IgG化区域）和甚至整个蛋白质（如含有绿色英光蛋白（"GFP")发色团 的蛋白质）的融合体有特别的用途。融合蛋白可W通过构建与编码不同蛋白质或肤的核酸 序列同框的编码多肤或其片段的核酸并随后表达该融合蛋白来重组产生。可选地，融合蛋 白可W通过将多肤或其片段与另一蛋白质交联来化学产生。
[012引本发明中使用的术语"抗体"是指其至少一部分由至少一个免疫球蛋白基因或其 片段编码且能与希望的祀分子特异性结合的多肤。该术语包括天然存在的形式W及片段和 衍生物。
[0129] 术语"抗体"范围内的片段包括由使用各种蛋白酶消化产生的片段，由化学切割和 /或化学解离产生的片段W及重组产生的片段，只要该片段仍能特异性结合祀分子。在该些 片段中有F油、F油'、Fv、F (油'）2和单链Fv(scFv)片段。
[0130] 该术语范围内的衍生物包括进行过序列上的修饰但仍能够特异性结合祀分子的 抗体（或其片段），包括种间嵌合和人源化抗体、抗体融合体、杂聚抗体复合物和抗体融 合体，如双价抗体（双特异性抗体）、单链双价抗体和胞内抗体（见，例如Intracellular Antibodies:Research and Disease Applications, (Marasco,作者，Springer-Verlag New York, Inc.，1998)，其公开被整体纳入本文作为参考。
[0131] 如本发明中使用的，抗体可W由任何已知的技术产生，包括从天然B淋己细胞的 细胞培养物中收获，从杂交瘤的培养物中收获、重组表达系统和瞻菌体展示。
[0132] 术语"非肤类似物"是指具有与参考肤的特性相似的特性的化合物。非肤化合物可 W被称为"肤模拟物"或"拟肤"。见，例如，Jones, Amino Acid和化ptide Synthesis, Oxford University Press (1992) ；Jung, Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries:A Handbook, John Wiley (1997) ；Bodanszky 等,Peptide Chemistry-A Practical Textbook, Springer Verlag(1993) ；Synthetic Peptides:A Users Guide, (Grant,作 者，W. H. Rreeman 和 Co. , 1992) ;Evans 等，J. Med. Qiem. 30:1229 (1987) ;Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29(1986) ;Veber 和 Rreidinger, Trends Neurosci., 8:392-396 (1985)，及上 述各文献中引用的参考文献，其纳入本发明作为参考。该样的化合物通常在计算机分子建 模的辅助下开发。与本发明中有用的肤结构相似的肤模拟物可W用于产生等同的效果，且 因此被设想为本发明的一部分。
[013引"多肤突变体"或"突变蛋白"是指与天然或野生型蛋白质的氨基酸序列相比，其序 列包含一个或多个氨基酸的插入、重复、缺失、重排或置换的多肤。突变蛋白可W是在自然 发生的蛋白质的序列中具有一个或多个氨基酸点置换，其中一个位置上的单个氨基酸被改 变成另一种氨基酸、一个或多个插入和/或缺失，其中一个或多个氨基酸分别被插入或缺 失，和/或在氨基或駿基端任一端或在两端截短。与自然发生的蛋白质相比，突变蛋白可W 具有相同，但优选具有不同的生物活性。
[0134] 突变蛋白与野生型对应物具有至少85 %的整体序列同源性。甚至更优选是与野生 型蛋白质具有至少90 %的整体序列同源性的突变蛋白。
[0135] 在甚至更优选的实施方式中，突变蛋白显示至少95%的序列同一性，甚至更优选 98 %，甚至更优选99 % W及甚至更优选99. 9 %的整体序列同一性。
[0136] 序列同一性可W通过任何普通的序列分析算法，如Gap或Bestfit来测定。
[0137] 氨基酸置换可W包括；（1)降低对蛋白水解的敏感性，（2)降低对氧化的敏感性， (3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，（4)改变结合亲和力或酶活性，和（5)赋予或改变 该类类似物的其他物理化学或功能特性的置换。
[013引如本发明中使用的，二十种常见氨基酸和其缩写遵循常规用法。见Immunology-A Synthesis (Golub 和 Gren 编牵茸，Sinauer Associates, Sunderland, Mass.,第二片反，1991), 其纳入本发明作为参考。二十种常见氨基酸的立体异构体（例如D-氨基酸）、非天然氨基 酸如a-，a-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸和其他非常见氨基酸也可W是本发明多肤的适 合组分。非常见氨基酸的例子包括；4-轻脯氨酸、y-駿基谷氨酸、e-N，N，N-H甲基赖氨 酸、e -N-己醜基赖氨酸、0-磯酸丝氨酸、N-己醜基丝氨酸、N-甲醜基甲硫氨酸、3-甲基组 氨酸、5-轻赖氨酸、N-甲基精氨酸W及其他相似氨基酸和亚氨基酸（如4-轻脯氨酸）。在 本发明中使用的多肤符号中，按照标准的用法和规则，左手端对应氨基末端和右手端对应 駿基末端。
[0139] 如果编码蛋白质的核酸序列具有与编码第二种蛋白质的核酸序列相似的序列，该 蛋白质与第二种蛋白质具有"同源性"或者是与其"同源的"。可选地，如果两种蛋白质有 "相似"的氨基酸序列，蛋白质与第二种蛋白质具有同源性。（因此，术语"同源蛋白质"定 义为表示两种蛋白质具有相似的氨基酸序列。）如本发明中使用的，氨基酸序列两个区域间 的同源性（特别是关于预测的结构相似性）被解释为暗示了功能上的相似。
[0140] 当对蛋白质或肤使用"同源的"时，公认的是不相同的残基位置通常因保守的氨 基酸置换而不同。"保守的氨基酸置换"是其中氨基酸残基由另一种带具有相同化学性能 (如电荷或疏水性）的侧链巧基）的氨基酸残基置换。通常，保守的氨基酸置换基本不 会改变蛋白质的功能特性。在两个或多个氨基酸序列由于保守氨基酸置换而互不相同的 情况下，序列同一性百分数或同源度可W上调W对于置换的保守性进行校正。进行该种调 整的方法本领域技术人员公知的。见，如化arson, 1994, Methods Mol. Biol. 24:307-31和 25:365-89 (纳入本发明作为参考）。
[014。 下列六组各包括互为保守置换的氨基酸；1)丝氨酸（S)、苏氨酸（T) ;2)天口冬氨 酸做、谷氨酸似；扣天口冬醜胺㈱、谷氨醜胺㈱；4)精氨酸佩、赖氨酸似巧异亮 氨酸（I)、亮氨酸（L)、蛋氨酸（M)、丙氨酸（A)、额氨酸（V)和6)苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、 色氨酸（W)。
[0142] 多肤的序列同源性，也被称为序列同一性百分数，通常使用序列分析软件 测定。 见，女口 Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group (GCG),University of Wisconsin Biotechnology Center,910University Avenue, Madison, Wis. 53705。蛋白质分析软件使用赋于各种置换、缺失和包括保守氨基酸 置换的其他修饰的同源性测量值来匹配相似序列。例如，GCG包含如"Gap"和"Bestfit"的 程序，该些程序可W默认参数使用W确定密切相关的多肤，如来自不同生物种的同源多肤 之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。见，如GCG版本6. 1。
[0143] 当比较特定多肤序列和包含来自不同生物体的大量序列的数据库时，优选 的算法是计算机程序 BLAST (Altschul 等，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990) ;Gish 和 States,化1:脚6 Genet. 3:266-272(1993) ;Madden 等，Meth.Elnzymol. 266:131-141 (1996); Altschul 等，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997) ;Zhang 和 Madden, Genome Res. 7:649-656(1997))，特别是 blas1:p 或忧 lastn(Altschul 等，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))。
[0144] BLAS化优选的参数为；期望值10 ;(默认）；过滤器；seg(默认）；开放空位罚分： 11(默认）；扩展空位罚分；1(默认）；最大比对；1〇〇(默认）；字段大小；11(默认）；描述 编号；1〇〇(默认）；罚分矩阵；BL0WSUM62。
[0145] 比较同源性的多肤序列的长度一般至少约16个氨基酸残基，经常至少约20个残 基，更经常至少约24个残基，通常至少约28个残基，优选多于约35个残基。当检索包含来 自大量不同生物体的序列的数据库时，优选比较氨基酸序列。使用氨基酸序列的数据库检 索可W通过本领域已知的非bias化算法测定。例如，可W使用FASTA，GCG版本6. 1中的 程序来比较多肤序列。FASTA提供查询和检索序列间最佳重叠区域的比对和序列同一性百 分数。化arson, MethodsEnzymol. 183:63-98(1990)(纳入本发明作为参考）。例如，如GCG 版本6. 1(纳入本发明作为参考）中提供的，氨基酸序列间的序列同一性百分数可W使用 FASTA W其默认参数（2的字段大小和PAM250得分矩阵）确定。
[0146] "特异性结合"是指两个分子优先于与环境中的其他分子结合而相互结合的能力。 通常，"特异性结合"区别于反应中的偶然结合至少2倍、更通常至少10倍，经常至少100 倍。通常，如通过解离常数量化的，特异性结合反应的亲和力或亲合力约为1(T 7M或更强（女口 i(r8M、i(r9M或甚至更强）。
[0147] "干细胞重百分数"是指如下获得的姪产生的测量；浓缩一定体积的培养物W团聚 细胞。通过至少一个微量离也和吸出循环来清洗细胞并去湿。细胞团冻干过夜，再次称量含 有干细胞团