基于特异性ss-coi引物的棉黑蚜pcr快速检测方法
【专利说明】基于特异性SS-COI引物的棉黑蚜PCR快速检测方法 一、技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及棉黑蚜PCR检测方法，具体为一种基于特异性 C0I引物的PGR检测方法。 二、
【背景技术】
[0002] 棉黑财（Aphis atrata Zhang)属同翅目，财科。又称紫团财。分布于新疆、宁夏、 甘肃等地。寄主植物有棉花、苦豆子，少量在苜蓿上。
[0003] 棉黑蚜是新疆棉花苗期害虫，喜群集于棉苗嫩头、子叶、真叶反面吸食汁液为害， 使棉叶皱缩，生长点枯萎脱落，腋芽丛生，棉株矮化畸形，使棉苗发育早期停滞，花蕾减少， 产量下降。
[0004] 利用自然天敌对田间害虫进行生物防治，是农业生产中植保工作的有效手段之 一。捕食性天敌对蚜虫具有明显的捕食作用，研宄天敌对蚜虫捕食作用的方法很多，传统的 方法主要采用田间直接观察，消化道解剖观察、以及生化方法，如酶联免疫法（ELISA)、同功 酶电泳、蛋白质电泳分析等，但这些方法都有耗时长、操作复杂、费用高等局限性。目前，DNA 追踪技术被逐步应用到研宄田间天敌和害虫的食物链营养关系以及筛选优势天敌方面，是 构建复杂的农业生态系统中节肢动物间食物网的有效工具之一。
[0005] Species-Specific-COI PCR检测技术是在mtDNACOI技术的基础上发展起来的特 异序列扩增区域标记，是利用物种特异性C0I引物（SS-C0I)，根据预期DNA条带的有无来鉴 定检测样本，无需测序和序列比对，其具有灵敏度高、特异性强、重复性好、快速、简便等优 点。中国专利说明书CN103436618A公开的棉蚜特异性SS-C0I引物、含有该引物的试剂盒 及其检测方法即是该方法的具体应用。
[0006] 但棉黑蚜由于分布区域有限，相关研宄开展较少，在Genbank上尚未检索到棉黑 蚜C01基因片段。因此该方法尚未在棉黑蚜的检测方面得以应用。 三、
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种基于特异性SS-C0I引物的棉黑蚜PCR快速检测方法。
[0008] 本发明根据棉黑蚜的线粒体DNA C0I序列，设计一对棉黑蚜的特异性C0I引物，具 体为
[0009] 正向引物 Aal05-1F :5' -TCCCATAATAATAGGTTGTC-3'
[0010] 反向引物 Aal05-1R :5' -TACCTGCTAAATGAAGAGAG-3'。
[0011] 本发明的检测步骤为：
[0012] (1)提取样品总DNA;
[0013] (2)以上述步骤提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物Aal05-1F和 Aal05-1R进行PCR扩增反应；反应体系以20 y L计为：
[0014]
【主权项】
1. 一种基于特异性SS-COI引物的棉黑蚜PCR快速检测方法，其特征在于所述的引物为 正向引物 Aal05-1F :5' -TCCCATAATAATAGGTTGTC-3' 反向引物 Aal05-1R :5' -TACCTGCTAAATGAAGAGAG-3' 检测步骤为： a. 提取样品总DNA ; b. 以上述步骤提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物Aal05-1F和Aal05-1R 进行PCR扩增反应；反应体系以20 μ L计为：
反应条件为：94°C 3分钟，94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 1分钟，共45个循环；之后 72 °C 10 分钟。 c. 对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如出现大小为2IObp的DNA条带，则表明 样品为棉黑虫牙。
2. 含有权利要求1所述引物的用于检测棉黑蚜的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包 括棉黑蚜基因组DNA标准阳性模板。
【专利摘要】基于特异性SS-COI引物的棉黑蚜PCR快速检测方法，是根据棉黑蚜特有的mtDNA COI序列，设计了一对棉黑蚜特异性的COI引物Aa105-1F和Aa105-1R，该引物只对棉黑蚜具有特异性扩增效果，扩增产物大小为210bp，DNA最低检出浓度为0.192ng/μL。用于植保领域棉黑蚜优势天敌确定及食物链分析，特异性强，准确率高，方便快捷。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104673890
【申请号】CN201410697874
【发明人】王冬梅, 丁瑞丰, 刘建, 李海强, 李号宾, 徐遥, 阿克旦, 汪飞, 李广阔
【申请人】新疆农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2014年11月19日