30](11)基础培养基1L，其组成及各组分的浓度为:NH4NO3:1.7g.Ι^，KH2PO4:1.0g.ΙΛ K2HPO4:1.0g.L-1，MgCl2:0.30g.L Λ CaCl2.2H20:0.15g.L'
[0031](12)微量金属液1L，其组成及各组分的浓度为:CoCl2.6H20:55mg.L-1，CuCl2:
0.35mg.L \ H3BO3:11.0mg.L 1, MnCl2.4H20:45mg.L \ Na2MoO4.2H20:5.5mg.L \NiCl2.2H20:4.5mg.?Λ ZnCl2:4.5mg.L'
[0032]实施例
[0033]向已加入苯并[ghi]茈及基础培养基、微量金属液和维生素c溶液的玻璃瓶内接种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株羽扇豆苍白杆菌Ochrobactrum lupini DW3，然后将培养瓶在培养温度为25?28°C、转速为100r/min的振荡器中培养20d，得到扩增培养后的菌液。将菌液在10000r/min条件下离心lOmin，向分离的菌体中加入1mL pH值为9.0浓度为0.08M的NaH2POjl冲液，旋涡振荡5min后再进行超声波振荡15min，在10000r/min条件下离心lOmin，弃去上清液后加入7mL溶液A并混合均匀。然后加入2.2mg N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，在O?4°C条件下振荡1min后加入
1.5mL浓度为50g/L的乙氧基化烷基硫酸钠溶液，旋涡振荡5min后在55°C条件下水浴振荡lh，在10000r/min条件下离心lOmin，收集上清液。然后向收集到的上清液中加入ImL浓度为5.5M的醋酸钾和0.5mL异丙醇，在O?4°C条件下振荡15min，在10000r/min条件下离心lOmin，收集上清液。将收集到的上清液加入到离心纯化柱中，然后在10000r/min条件下离心lOmin，倒去离心管中的液体。重复这一过程，直至所有的上清液都经过离心纯化柱纯化。向离心纯化柱中加入0.5mL溶液B，在10000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体。然后向离心纯化柱中加入0.6mL溶液C，在55°C条件下振荡20min，在1000r/min条件下离心5min。将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在55°C水浴中放置lOmin，在10000r/min条件下离心5min。离心管中液体即为含有降解苯并[ghi]花功能基因的质粒溶液，在-20 °C保存备用。
[0034]运用电转化的方法将含有降解苯并[ghi]茈功能基因的质粒转入到大肠杆菌BL21中，得到的重组菌能够在以苯并[ghi]茈为唯一碳源的无机盐培养基中生长，且对苯并[ghi]茈具有降解功能，运用得到的重组菌对初始浓度为0.07mg/L的苯并[ghi]茈溶液进行降解试验，结果表明7天后苯并[ghi]茈的去除率达到43.9%。
【主权项】
1.一种含有能够降解苯并[ghi]花功能基因的质粒，其特征在于，该质粒由菌株羽扇豆苍白杆菌Ochrobactrum lupini DW3的菌液经过提取与纯化得到的，菌株羽扇豆苍白杆菌Ochrobactrum lupini DW3的菌种保藏号为CGMCC N0.8623，其中，从菌株羽扇豆苍白杆菌Ochrobactrum lupini DW3中提取与纯化含有降解苯并[ghi]花功能基因的质粒的具体方案为: (1)向体积为500mL的锥形瓶内加入400mL基础培养基、1.0mL微量金属液、0.1mL质量浓度为10mg/L的维生素c溶液，摇匀后作为液体培养基备用；其中基础培养基的组成为:NH4NO3:1.7g.厂\ KH2PO4:1.0g.L K.2HP04:1.0g.厂\ MgCl2:0.30g.L CaCl2.2H20:.0.15g.ΙΛ 微量金属液的组成为:CoCl 2.6H20:55mg.?Λ CuCl2:0.35m g.Γ1，H3BO3:.11.0mg.ΙΛ MnCl2.4H20:45mg.?Λ Na2MoO4.2H20:5.5mg.?Λ NiCl2.2H20:4.5mg.?ΛZnCl2:4.5mg.L S (2)在超净工作台中向体积为10mL的锥形瓶中加入6.0mL浓度为lg/L的苯并[ghi]茈丙酮溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天； (3)向步骤⑵中的锥形瓶内加入60mL按步骤⑴配制的液体培养基； (4)在超净工作台中挑取菌株羽扇豆苍白杆菌Ochrobactrumlupini DW3，将其接种至步骤(3)中的锥形瓶中，在温度为25?30°C、转速为100r/min的振荡器中培养.20?22天; (5)将步骤(4)中的菌液转移到容积为15mL的离心管中，在10000r/min条件下离心.lOmin，弃去上清液； (6)向步骤(5)中的离心管中加入1mLpH值为9.0浓度为0.08M的NaH2PO4缓冲液，旋祸振荡5min后再进行超声波振荡15min，在10000r/min条件下离心lOmin，弃去上清液分离出菌体； (7)向由步骤(6)的离心管中加入7mL溶液A，然后混匀；溶液A的组成为:50mL0.45M三羟基甲基氨基甲烷-HCl，20mL 0.25M EDTA，20mL 0.9M KC1，1mL百分比浓度为2.0%的氯化十六烷基三甲胺，PH 8.2;然后加入2.2mg N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，在O?4°C条件下振荡1min后加入1.5mL浓度为50g/L的乙氧基化烷基硫酸钠溶液，旋涡振荡5min后在55°C条件下水浴振荡lh，在10000r/min条件下离心lOmin，收集上清液； (8)向由步骤(7)得到的上清液中加入ImL浓度为5.5M的醋酸钾和0.5mL异丙醇，在.O?4°C条件下振荡15min，在10000r/min条件下离心lOmin，收集上清液； (9)将由步骤(8)得到的上清液加入到离心纯化柱上，将离心纯化柱放入离心管中，在10000r/min条件下离心lOmin，倒去离心管中的液体；重复这一过程，直至所有由步骤(8)得到的上清液都经过离心纯化柱纯化； (10)向经步骤(9)处理后的离心纯化柱中加入0.5mL溶液B，溶液B的组成为:5mL.4.5M盐酸胍，1mL 3.5M醋酸钾与85mL无水乙醇，pH 7.0 ;在O?4°C条件下振荡15min，在10000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体； (11)向经步骤(10)处理后的离心纯化柱中加入0.6mL溶液C，溶液C的组成为:40mL1mM 三羟基甲基氨基甲烷-HCl，30mL 3.0M NaCl，30mL 1.5mM EDTA, pH 8.5 ;在 55°C条件下振荡20min，在10000r/min条件下离心5min ;将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在55°C水浴中放置lOmin，在10000r/min条件下离心5min ;离心管中液体即为含有 降解苯并[ghi]茈功能基因的质粒溶液，在_20°C保存备用。
【专利摘要】本发明提供了一种含有能够降解苯并[ghi]苝功能基因的质粒。所述含有降解苯并[ghi]苝功能基因的质粒由菌株羽扇豆苍白杆菌Ochrobactrum lupini DW3的菌液经过提取与纯化得到的。向加入苯并[ghi]苝及基础培养基、微量金属液和维生素c溶液的玻璃瓶内接种菌株羽扇豆苍白杆菌Ochrobactrum lupini DW3，培养20天后得到菌液，对菌液经过提取与纯化得了到含有降解苯并[ghi]苝功能基因的质粒。本发明得到的含有降解苯并[ghi]苝功能基因的质粒可以构建对苯并[ghi]苝具有降解功能的菌株，提高以苯并[ghi]苝为代表的多环芳烃污染物的生物降解效果，对于多环芳烃苯并[ghi]苝污染土壤及水体有应用潜力。CGMCC No.862320131220
【IPC分类】C12N15-11, C12N15-10, C12R1-01
【公开号】CN104711258
【申请号】CN201510097224
【发明人】谢恩, 郑蕾, 朱宜, 丁爱中, 豆俊峰
【申请人】北京师范大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月5日