构成（限制性酶切图）的图。
[0062] 图2是表示金属离子对本发明的酶活性产生的影响的图。
[0063] 图3是表示温度对最适酶活性产生的影响（a)与保温1小时后的稳定性（b)的图。
[0064] 图4是表示pH对最适酶活性产生的影响（a)与保温24小时后的稳定性（b)的图。
[0065] 图5表示本发明的酶的基质特异性的图。
[0066] 图6表示反应前（D-阿洛酮糖）和反应后（D-阿洛酮糖、D-阿卓糖、D-阿洛糖混 合液）的HPLC分析的图。
【具体实施方式】
[0067] D-阿洛糖是非常有用的稀少糖之一，对癌细胞的增殖抑制产生重要的作用。Arnold和Silady报告了D-阿洛糖不产生其它有害的临床影响，实质上阻碍分叶核嗜中性 白细胞的产生，降低血小板数（专利文献7)，还报告了阻碍活性氧的产生（非专利文献3)。 对于D-阿洛糖，这几年特别是对抗癌作用进行了多种研宄。因此，本发明者们以从能够用 于食品制造的安全菌种中得到将D-阿洛酮糖转变为D-阿洛糖的酶作为能够大量且安全地 制造该有用的D-阿洛糖的方法为目的，进行了专门研宄。
[0068] 作为对由D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的反应进行催化的酶之一，有L-鼠李 糖异构酶（L-Rhl，E.C:5. 3. 1. 14)，其为对可逆地异构化为作为与L-鼠李糖对应的酮糖的L-鼠李树胶糖（L-rhamnulose)的反应进行催化的酶，在大肠杆菌(Escherichiacoli)(非 专利文献2)中被人所知，但是不能说是哪个安全地用于食品制造中的菌。
[0069] 因此，本发明者们为了确立能更容易地生产该产业上有希望的D-阿洛糖的方法， 从土壤中分离放线菌制作库，从该库中探索生产由D-阿洛酮糖转变为D-阿洛糖的异构酶 的菌。
[0070]作为本发明中的能够由D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖的酶，使用上述具有来自属于 链霉菌属(Streptomyces)的微生物的序列号1或来自微生物的序列号2所记载的氨基酸 序列的具有由D-阿洛酮糖转变为D-阿洛糖的活性的蛋白质。
[0071] 通常可以从得到的培养菌体中提取作为目标的酶直接用于反应，但优选以固定化 后的形态使用。作为固定化的对象的具有上述活性的酶本身可以是根据使用目的不一定经 过高纯度精制的酶，即使是粗酶也可以使用。作为粗酶的具体例子，可以使用具有生产有上 述活性的酶的能力的微生物本身，另外，可以使用其培养物或部分精制后的培养物。
[0072] 上述固定化酶可以例如对作为本发明的目标的酶通过载体结合法、交联法或者包 埋法等规定的方法进行固定化来使用。其不限定于酶，可以通过将菌体本身或粗酶相对于 树脂等载体进行固定化等而得到。通过固定化，可以得到到此为止1周左右的稳定性能保 持数个月的稳定性的固定化酶。
[0073] 例如，通过在将作为本发明的目标的酶和/或微生物利用载体结合法中之一的共 价结合法固定化后得到的固定化酶和/或固定化微生物中通入含有50%乙醇的D-阿洛酮 糖溶液，将稳定控制为反应时为42°C、结晶化时为4°C，由此可以连续地制造D-阿洛糖的结 晶。另外，通过不对该结晶化后的滤液进行乙醇除去、浓缩而将其再次通入上述固定化酶和 /或固定化微生物中，可以再次连续地制造D-阿洛糖。
[0074] 这是通过在D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的混合溶液中添加乙醇从而可以仅仅分离 D-阿洛糖的划时代的方法，而且也不需要除去用于酶反应的缓冲液，从而具有如下非常大 的优点：大幅度地节省分离过程，可以高效化。在将50%D-阿洛酮糖作为原料以酶反应 生产D-阿洛糖的情况下，由于作为35%D-阿洛酮糖和15%D-阿洛糖的混合溶液得到了 产物，因此，能够迅速地从酶反应产物中分离D-阿洛酮糖和D-阿洛糖，从而得到高纯度的 D-阿洛糖。
[0075] 在本发明中，例如，由D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖的情况下的酶反应通常以下述的 条件进行。即，作为基质含有D-阿洛酮糖的溶液通常使用水溶液，其基质浓度可以从1~ 60w/v%、优选为10~50w/v%、更加优选为20~40w/v%的范围适当选择。酶反应温度可 以从酶不失活的温度，例如10~85°C、优选为40~80°C、更加优选为最适温度60°C中进行 选择。同样地，酶反应pH可以从6.0~11.0、更加优选为最适pH9.0中进行选择。酶活性 可以从每克基质为1单位以上、以外50~5, 000单位的范围内进行选择。反应时间根据使 用的基质量、酶量、温度、pH条件等而变动，如果以不采用固定化酶而采用分批式的情况为 例，则考虑到经济性，优选在约2~100小时、优选为约5~50小时的范围内进行。
[0076] 本发明涉及一种D-阿洛糖的生产方法，其特征在于，使下述（a)至（c)中任一记 载的具有活性的蛋白质作用于D-阿洛酮糖将其异构化为D-阿洛糖，S卩，通过安全性高的放 线菌所产生的由D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖的酶，从D-阿洛酮糖制造D-阿洛糖。
[0077] (a)由序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列构成的具有上述活性的蛋白质；
[0078] (b)由序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基被置 换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列构成的具有上述活性的蛋白质；
[0079] (c)由与序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列具有60%以上的同源性的氨基 酸序列构成的具有上述活性的蛋白质。
[0080] 上述蛋白质的L-鼠李糖异构酶活性是由以下（d)~（f)的物理化学性质来特定 的。
[0081] (d)作用pH和最适pH，
[0082]作用pH为 6.0 ~11.0,最适pH为 9.0 ;
[0083] (e)作用温度和最适温度，
[0084] 作用温度为10~80°C，最适温度为60°C;
[0085] (f)对于L-鼠李糖、D-木糖、D-核糖、D-阿洛糖、D-葡萄糖以及L-阿拉伯糖有反 应性。
[0086] [D-阿洛酮糖]
[0087] 本发明中使用的D-阿洛酮糖可以用各种方法进行制造，例如，可以列举将D-果糖 表异构化来生产；将D-葡萄糖异构化（Isomerization)转变为D-果糖，将该D-果糖表异 构化（Epimerization)来生产；由未利用资源得到D-葡萄糖，将该D-葡萄糖异构化转变为 D-果糖，将该D-果糖表异构化来生产D-阿洛酮糖等。
[0088] 通过实施例来进一步详细地说明本发明，但是本发明并没有被任何实施例限定。
[0089] 实施例1
[0090][具有由D-阿洛酮糖转变为D-阿洛糖的能力的酶的生产菌株的取得]
[0091] 将0. lg由环境采取的土壤悬浊于lmL灭菌蒸馏水中。用灭菌蒸馏水将该悬浊液 稀释50倍，将其中0.lmL接种于放线菌分离培养基中，在30°C下培养3天。提取出现的菌 落（约200株）。放线菌分离培养基使用了表1的组成的放线菌培养基。
[0092] [表1]
【主权项】
1. 一种蛋白质，其中， 具有如下活性：识别醛糖Cl的CHO基团和C2的OH基团并进行反应，将Cl的CHO基团 转变为OH基团，将C2的OH基团转变为CO基团；或者识别酮糖Cl的OH基团和C2的CO基 团并进行反应，将Cl的OH基团转变为CHO基团，将C2的CO基团转变为OH基团； 并且，所述蛋白质是下述（a)至（c)中任一记载的蛋白质： (a) 由序列号1或序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质； (b) 由序列号1或序列号2所示的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基被置换、添加、 插入或缺失而成的氨基酸序列构成的蛋白质； (c) 由与序列号1或序列号2所示的氨基酸序列具有60%以上的同源性的氨基酸序列 构成的蛋白质。
2. 如权利要求1所述的蛋白质，其中， 将酮糖的D-阿洛酮糖异构化为醛糖的D-阿洛糖。
3. 如权利要求1或2所述的蛋白质，其中， 所述蛋白质是由以下（d)~（f)的物理化学性质特定的， (d) 作用pH和最适pH， 作用pH为6.0~11.0,最适pH为9.0 ; (e) 作用温度和最适温度， 作用温度为10~80°C，最适温度为60°C; (f) 对于L-鼠李糖、D-木糖、D-核糖、D-阿洛糖、D-葡萄糖以及L-阿拉伯糖有反应 性。
4. 一种来自链霉菌（Streptomycessd.)710 或链霉菌（Streptomycessp. )720 的DNA， 其中， 编码由序列号3或序列号4所示的碱基序列或其互补序列、或者包含这些序列的一部 分或全部的序列构成的权利要求1或2所述的蛋白质，所述链霉菌710的保藏号为NITE BP-01423,所述链霉菌720的保藏号为NITEBP-01424。
5. -种重组载体，其中， 包含权利要求4所述的DNA。
6. -种宿主细胞，其中， 包含能够表达权利要求1、2或3所述的蛋白质的表达体系。
7. -种重组蛋白质的制造方法，其特征在于， 在培养基中培养权利要求6所述的包含表达体系的宿主细胞，从得到的培养物中采取 权利要求1、2或3所述的重组蛋白质。
8. -种D-阿洛糖的生产方法，其特征在于， 使权利要求1、2或3所述的蛋白质作用于D-阿洛酮糖，将D-阿洛酮糖异构化为D-阿 洛糖。
9. 如权利要求8所述的D-阿洛糖的生产方法，其中， D-阿洛酮糖是将D-果糖表异构化来生产的。
10. 如权利要求8所述的D-阿洛糖的生产方法，其中， D-阿洛酮糖是将D-葡萄糖异构化转变为D-果糖，将该D-果糖表异构化来生产的。
11. 如权利要求8所述的D-阿洛糖的生产方法，其中， D-阿洛酮糖是由未利用资源得到D-葡萄糖，将该D-葡萄糖异构化转变为D-果糖，将 该D-果糖表异构化来生产的。
12. 如权利要求8~11中任一项所述的D-阿洛糖的生产方法，其中， 作为目标的D-阿洛糖为D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的混合物。
【专利摘要】本发明提供一种安全性高的微生物所产生的具有由D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的活性的酶蛋白质。下述(a)至(c)中任一记载的具有将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的活性的蛋白质。(a)由来自属于链霉菌属的微生物710株(保藏号：NITE BP-01423)的序列号1或来自微生物720株(保藏号：NITE BP-01424)的序列号2所记载的氨基酸序列构成的具有将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的活性的蛋白质；(b)由序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基被置换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列构成的具有将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的活性的蛋白质；(c)由与序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列构成的具有将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的活性的蛋白质。NITE BP-0142420131030 NITE BP-0142320131007
【IPC分类】C12N1-21, C12N1-15, C12P19-02, C12N5-10, C12N15-09, C12N9-90, C12N1-19
【公开号】CN104769109
【申请号】CN201380057161
【发明人】P·K·古洛帕利, 新谷知也, 西本幸史, 原园幸一
【申请人】松谷化学工业株式会社, 长濑产业株式会社, 长濑化成株式会社
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2013年10月30日
【公告号】EP2918677A1, WO2014069537A1