Bl基因）激酶结构域中的变异影响ATP结合口袋的构象结构。优 选地，EGFR激酶结构域中的变异是框内删除或外显子18、19、20或21中的取代。
[0022] 在一个实施方案中，所述框内删除在EGFR(erbBl)的外显子19中。优选地所述外 显子19中的框内删除在删除处至少由密码子747, 748, 749,和750上的氨基酸亮氨酸、精 氨酸、谷氨酸和丙氨酸组成。在一个实施方案中，所述框内删除包含核巧酸2235-2249并删 除氨基酸746-750 (序列谷氨酸，亮氨酸，精氨酸，谷氨酸和丙氨酸），见表2,表S2,图2B，图 4A，图5,图6C，和图8C。在另一个实施方案中，所述框内删除包含核巧酸2236-2250并删除 氨基酸氨基酸746-750，见表S2，图5，和图6C。或者，所述框内删除包含核巧酸2240-2251， 见表2,图2C，图4A，图5,或核巧酸2240-2257,见表2,表S3A，图2A，图4A，图5,图6C，和 图8E。或者，所述框内删除包含核巧酸2239-2247与在核巧酸2248上的半脱氨酸对鸟嚷 岭的取代，见表S3A和图8D，或核巧酸2238-2255的删除和核巧酸2237上的胸腺喀晚对 腺嚷岭的取代，见表S3A和图8F，或核巧酸2254-2277的删除，见表S2(SEQIDNO;437)。 或者，所述删除包含核巧酸 2239-2250delTTAAGAGAAGCA(SEQIDN0;554) ;2251A>C，或 2240-2250delTAAGAGAAGCA(SEQIDN0;720)，或 2257-2271delCCGAAAGCCAACAAG(SEQID NO;721)，如表S3B中所示。
[0023] 在另一个实施方案中，所述取代在EGFR的外显子2中。所述外显子2中的取代包 含至少一个氨基酸。在一个实施方案中，所述外显子2中的取代在核巧酸2573上包含一个 鸟嚷岭对胸腺喀晚的取代，见图4A和图5。该种取代导致氨基酸取代，其中野生型亮氨酸 在氨基酸858上被精氨酸所替换，见图5,表2,表S2,表S3A，图2D，图6A，图8B，和SEQID NO;512。或者，所述外显子2中的取代在核巧酸2582上包含一个腺嚷岭对胸腺喀晚的取 代，见图4A和图5。该种取代导致了氨基酸取代，其中野生型亮氨酸在氨基酸861上被谷 氨酷胺所替换，见图5(分别是SEQIDN0S740-762，^出现的顺序），表2(分别是SEQID NOS730-739，^出现的顺序），图2E，表S3B(分别是SEQIDNOS554&720-729，W出现的顺 序），和SEQIDN0;512。
[0024] 所述取代还可W在EGFR的外显子18中。在一个实施方案中，所述外显子18中的 取代是在核巧酸2155上胸腺喀晚对鸟嚷岭的取代，见图4A和图5。该种取代导致了氨基酸 取代，其中野生型甘氨酸在密码子719上被半脱氨酸所取代，见图5,SEQIDNO;512。在另 一个实施方案中，所述外显子18中的取代是在核巧酸2155上腺嚷岭对鸟嚷岭的取代，导致 氨基酸取代，其中野生型甘氨酸在密码子719上被丝氨酸所取代，见表S2,图6B，图8A，图5 和沈QIDNO;512。
[00巧]在另一个实施方案中，所述取代是在如图5所示的核巧酸2316之后和核巧酸2317 之前鸟嚷岭，鸟嚷岭和胸腺喀晚佑GT)的插入（23162317insGGT)。该也可W描述为鄉氨酸 (V)在氨基酸772上的插入（P772_H733insV)。其它的突变显示于表S3B中并包括，例如， 在如图5所示的的核巧酸2309之后和核巧酸2310之前CAACCCGG的插入和在如图5所示 的的核巧酸2311之后和核巧酸2312之前GCGTGGACA的插入。所述取代还可W在外显子20 中并且在一个实施方案中为在核巧酸2334和2335上的AA对于GG的取代，见表S3B。
[0026] 总之，在优选的实施方案中，erbBl基因的核酸变异是在如图5所示的核巧酸 2155上胸腺喀晚对鸟嚷岭或腺嚷岭对鸟嚷岭的取代，在如图5所示的核巧酸2235-2249， 2240-2251，2240-2257, 2236-2250, 2254-2277,或 2236-2244 的删除，在如图 5 所示的核巧 酸2316之后和在核巧酸2317之前核巧酸鸟嚷岭，鸟嚷岭，和胸腺喀晚佑GT)的插入，化及 在如图5所示的核巧酸2573上鸟嚷岭对胸腺喀晚或在2582上腺嚷岭对胸腺喀晚的取代。
[0027] 通过扩增编码受体的核酸片段可W测定至少一个核酸变异的存在或缺失的检测。 待扩增的片段为1000核巧酸长，优选地，500核巧酸长，最优选100核巧酸长或更小。待扩 增的片段可W包括多种变异。
[0028] 在另一个实施方案中，至少一个核酸变异的存在或缺失的检测提供了将包含变异 位点的EGFR核酸与至少一种核酸探针接触。所述探针优选地与包括变异位点并且在变异 位点包含互补核巧酸的核酸序列在选择性杂交条件下杂交。杂交可W用可检测的标记进行 检测。
[0029] 在又一个实施方案中，至少一个核酸变异的存在或缺失的检测包括对至少一个核 酸序列进行测序并将获得的序列与已知的erbBl核酸序列比较。或者，至少一个核酸变异 的存在或缺失包含至少一个核酸序列的质谱测定。
[0030] 在优选的实施方案中，至少一个核酸变异的存在或缺失的检测包括进行聚合酶链 式反应（PCR)。扩增包含假定变异的erbBl核酸序列并测定扩增的核酸的核巧酸序列。测 定扩增的核酸的核巧酸序列包括对至少一个核酸片段进行测序。或者，通过利用任何能够 根据其大小分离扩增产物的方法，包括自动的和手动的凝胶电泳等等可W分析扩增产物。
[0031] 或者，至少一个核酸变异的存在或缺失的检测包括测定基因中多种变异的单倍 型。
[0032] 在另一个实施方案中，通过分析erbBl基因产物（蛋白质）t可W检测EGFR变异 的存在或缺失。在该种实施方案中，使用特异性结合变异EGH?的探针。在优选的实施方案 中，所述探针是优选结合到变异EGH?上的抗体。变异EGH?的存在预示着EGFR祀向性治疗 有效的可能性。或者，所述探针可W是抗体片段，嵌合性抗体，人源化抗体或适体。
[0033] 本发明进一步提供一种探针，其在选择性结合条件下特异性结合到在EGFR基因 (erbBl)中包含至少一个核酸变异的核巧酸序列上。在一个实施方案中，所述变异是在 erbBl的激酶结构域中的突变，其赋予ATP结合性口袋的结构变化。
[0034] 本发明的探针可W包含大约500个核巧酸碱基的核巧酸序列，优选大约100个核 巧酸碱基，最优选大约50个核巧酸碱基或大约25个核巧酸碱基或更小的长度。所述探针 可W由DNA，RNA，或肤核酸（PNA)组成。另外，所述探针可W包含可检测的标记，如例如，巧 光或酶学标记。
[003引本发明另外提供一种在受癌症影响的患者中测定表皮生长因子受体巧GFR)祀向 性治疗有效的可能性的新方法。所述方法包括测定来自患者的生物样品中的EGFR的激酶 活性。与正常对照相比，在用EGFR配体刺激之后激酶活性的提高表明EGFR祀向性治疗很 可能是有效的。
[0036] 本发明进一步提供一种治疗具有或处于形成癌症的危险之中的患者的新方法。所 述方法包括确定患者的EGFR的激酶结构域是否包含至少一种核酸变异。优选地，EGFR位 于肿瘤或癌症的位点上并且所述核酸变异是躯体性的。该种变异的存在表示EGFR祀向性 治疗将是有效的。如果所述变异存在，向患者施用酪氨酸激酶抑制剂。
[0037] 如上，向经鉴定的患者施用的酪氨酸激酶抑制剂可W是苯氨基嗟挫咐或不可逆的 酪氨酸激酶抑制剂，如例如，E邸-569,HKI-272和/或HKI-357 (Wyeth)。优选地，所述苯氨 基嗟挫咐是合成的的苯氨基嗟挫咐并且最优选地所述合成的的苯氨基嗟挫咐是gefitinib 和erlotinib。
[0038] 要通过本发明的方法治疗的癌症包括，例如，但不限于，胃肠癌、前列腺癌、卵巢 癌、乳癌、头颈癌、肺癌、非小细胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、膜癌、生 殖-泌尿系统癌和膀脱癌。在优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。
[0039] 还包括实施本发明的PCR方法的试剂盒。所述试剂盒包括至少一对设计来退火到 基因边界核酸区上的简并引物对，所述基因编码EGFR激酶结构域的ATP结合口袋。此外， 所述试剂盒包含实施PCR扩增所必需的产品和试剂，W及说明书。
[0040] 在优选的实施方案中，包含在试剂盒中的引物对选自SEQIDN0;505，SEQIDNO; 506，SEQIDN0;507,和SEQIDN0;508。在实施例中的表6和7中列出的引物也是优选 的。
[0041] 在又一个实施方案中，本发明公开了一种选择化合物的方法，所述化合物抑制变 异表皮生长因子受体巧GFR)的催化性激酶活性。作为第一步，将变异EGFR与可能的化合 物接触。随后检测所述变异EGH?得到的激酶活性并选择抑制变异EGH?的激酶活性的化合 物。在一个实施方案中，所述变异EGFR包含在细胞中。
[004引还可W使用所述方法选择变异EGFR的激酶活性的化合物，所述变异EGFR在激酶 结构域中具有次发突变，其赋予对TKI，例如gefitinib或erlotinib的耐受性。
[0043] 在一个实施方案中，对所述变异EGFR进行标记。在另一个实施方案中，将EGFR结 合到固体支持物上。在优选的实施方案中，所述固体支持物是蛋白质巧片。
[0044] 在本发明的又一个实施方案中，公开了一种抑制变异表皮生长因子受体巧GFR) 的催化性激酶活性的药物组合物。抑制变异EGH?的催化剂激酶活性的化合物选自抗体、抗 体片段、小分子、肤、蛋白质、反义核酸、核酶、PNA、siRNA、寡核巧酸适体，和肤适体。
[004引还公开了一种治疗患有EGFR介导性疾病的患者的方法。按照该方法，对患者施用 抑制变异表皮生长因子受体巧GFR)的催化性激酶活性的药物组合物。
[0046] 在一个实施方案中，所述EGFR介导性疾病是癌症。在优选的实施方案中，所述癌 症是上皮起源的。例如，所述癌症是胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、头颈癌、肺癌、非小细 胞肺癌、神经系统癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、膜癌、生殖-泌尿系统癌和膀脱癌。在 优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。
[0047] 在另一个实施方案中，公开了一种预测在erbBl基因的激酶结构域中获得次发突 变（或选择突变）的方法。将表达erbBl的变异形式的细胞与有效的，然而是亚致死剂量 的酪氨酸激酶抑制剂接触。选择抗酪氨酸激酶抑制剂生长阻滞作用的细胞并对erbBl核酸 分析erbBl激酶结构域中其它突变的存在。在一个实施方案中，所述细胞是体外的。在另 一个实施方案中，所述细胞获自转基因动物。在一个实施方案中，所述转基因动物是小鼠。 在此小鼠模型中，待研究的细胞获自肿瘤活检组织。通过本发明选择的在erbBl激酶结构 域中包含次发突变的细胞可W用在W上方法中W选择化合物，所述化合物抑制在激酶结构 域中具有次发突变的变异EGFR的激酶活性。
[0048] 在预测在erbBl基因的激酶结构域中获得次发突变的另一个实施方案中， 首先将表达erbBl基因变异形式的细胞与效量的诱变剂接触。所述诱变剂是，例 如，甲横酸己醋（EM巧，N-己基-N-亚硝基脈巧NU)，N-甲基-N-亚硝基脈（M