NU)， 地ocarbaxinehy化ochloride(Pre)，甲横酸甲醋（MeM巧，苯了酸氮芥（化1)，美法仑， porcarbazinehy化ochloride，环磯酷胺（Cp)，硫酸二己醋巧t2S〇4)，丙締酷胺单体（AA)， S亚己基密胺（TEM)，氮芥，长春新碱，二甲基亚硝胺，N-甲基-N'-硝基-亚硝基脈 (MNNG)，7，12二甲基苯并（a)慈值MBA)，环氧己烧，六甲基磯酷胺，bisulfan，或ethyl methanesul化rate巧tMs)。随后将细胞与有效的，但亚致死剂量的酪氨酸激酶抑制剂接触。 选择抗酪氨酸激酶抑制剂生长阻滞作用的细胞并对erbBl核酸分析erbBl激酶结构域中其 它突变的存在。
【附图说明】
[0049] 图1A-1B显示在顽固性非小细胞肺癌（NS化C)中Gefitinib反应的代表性图示。 病例6的胸腔CT扫描（表1)，显示（图lA)用gefitin化治疗前在右肺中的大的质量，（图 1B)在开始Gefitirdb治疗后的六周出现显者的改善。
[0050]图2显示Gefitinib反应性肿瘤中的EGFR突变。
[005。图2A-2C显示肿瘤样本中EGFR基因的核巧酸序列，在激酶结构域内具有杂合的框 内删除（双峰）（出现顺序分别为SEQ IDN0S643-644和690-699)。在有义和反义方向的 追踪显示证明了删除的两人断裂点；野生型核巧酸序列W大写字母显示，而突变序列W小 写字母显示。delL747-T751insS突变的5'断裂点的前面为T-C取代，其并不改变编码的 氨基酸。
[0052]图2D和图2E显示杂合的错义突变（箭头），导致在酪氨酸激酶结构域内的氨基酸 取代（SEQIDN0S70化703)。双峰代表杂合突变位点上的两个核巧酸。为了进行比较，还 显示了相应的野生型序列（SEQIDN0S700&702)。
[005引图2F是二聚EGFR分子被EGF配体结合的流程图。突出了细胞外结构域（包含两 种受体配体[L]-结构域和化rin-like结构域），跨膜区，和细胞质结构域（包含催化性激 酶结构域）。指出了用途受体激活标记的自体磯酸化位点的酪氨酸w68(Y-1068)的位置，W 及由EGFR自体磯酸化激活的下游效应剂（STAT3，MAP激酶（MAPK)，和AKT)。显示了肿瘤相 关突变的定位，都在酪氨酸激酶结构域中。
[0054]图3表明突变EGFR的增强的EGF依赖型激活和突变EGFR对Gefitinib提高的敏 感性。
[00巧]图3A显示野生型EGFR相比，在添加EGF到血清饥饿细胞中后de化747-P753insS和L858R突变体的配体诱导的激活时间过程。EGFR自体磯酸化被用作受体激活的标记，与 Cos-7细胞中表达的EGFR总体水平（对照；右板）相比，使用用特异性识别EGFR的磯酸化 酪氨酸胃残基的抗体的蛋白质印迹（左板）。在加入EGF(l〇ng/ml)的时间间隔上测量 EGFR的自体磯酸化。
[0056] 图3B是野生型和突变型受体磯酸化作用的EGF诱导的图示（见版A)。利用NIH 图像软件对来自S个独立实验的放射自显影进行量化；将EGFR磯酸化作用的强度规格化 为总体蛋白质表达，并显示为受体的百分比激活，带有标准偏差。
[0057] 图3C显示由Gefitinib产生的EGFR激活的剂量依赖型抑制。通过表达野生型 或突变型受体的Cos-7细胞的蛋白质印迹分析证明EGFR的酪氨酸1°68的自体磯酸化，并用 lOOng/ml的EGF刺激30min。如所示对细胞不处理（U)或用提高浓度的Gefitinib预处理 3虹S(左板）。表达的EGFR蛋白总量显示为对照（右板）。
[005引图3D显示来自对图版3C所述的两种实验的结果的量化（NIH图像软件）。将磯酸 化的EGFR浓度规格化为蛋白质表达水平并表示为受体的百分比激活。
[0059] 图4显示了在EGFR的ATP-结合性口袋内关键位点上的突变的聚类。
[0060] 图4A显示在多种NS化C情况下（SEQID N0S495-504值NA))，EGFR基因的外显 子19中重叠的框内删除和外显子21的错义突变的位置。对每种外显子显示部分核巧酸序 列，通过虚线标记删除并突出和对错义突变下划线；显示野生型EGFR核巧酸和氨基酸序列 (SEQID N0S493&494值NA)&509-510(氨基酸））。
[006。图4B显示EGFRATP裂口的立体结构，两翼是激酶结构域的氨基（脚和駿基似凸 起部（源自PDB1M14的等同物，并利用化3D软件展示）。抑制剂Gefitinib，图示占据ATP 裂口。显示了两种错义突变的定位，在激酶的激活性环内；=个框内删除都存在于另一个环 内，在ATP裂口侧翼。
[006引图4C显示EGFR激酶结构域的特写，显示与结合ATP或抑制剂相关的氨基酸残基。
[0063] 具体地，4-苯氨基嗟挫咐化合物如gefitinib通过占据ATP结合位点抑制催化， 其中它们与甲硫氨酸793 (M793)和半脱氨酸775 (C775)残基形成氨键，而它们的苯胺环接 近甲硫氨酸766 (M766)，赖氨酸化745)，和亮氨酸788 (L788)残基。预测突变所祀向的环内 的框内删除相对于抑制剂改变该些氨基酸的位置。显示突变的残基在酪氨酸激酶的激活环 内。
[0064] 图5显示erbBl基因的核巧酸和氨基酸序列。所述氨基酸被描述为本领域技术人 员已知的单个字母。通过患者数目来突出激酶结构域中的核巧酸变异，见表2。如图5所示 的包括核巧酸1到3633。SEQIDNO;512包括氨基酸1到1210。
[006引图6A-6C;在EGFR和B-Raf激酶结构域内的选定区的序列比对。人NS化C中EGFR 突变的描绘。iEGFR(gb;X00588;)NSCLC肿瘤中的突变W灰色突出显示。在多种肿瘤类型 (5)中的B-Raf(gb;M95712)突变W黑色突出显示。星号表示残基EGFR和B-Raf之间保守 的残基。图6A描绘了激活环中的L858R突变（SEQIDN0S477-479)。图她描绘了P环中 的G719S突变（SEQIDN0S480-482)。图6C描绘了EGFR外显子19中的删除突变（SEQID NOS483-489)0
[0066] 图7 ;EGFR激酶结构域的S维结构中的错义突变G719S和L858R和De^l删除的位 置。激活环W黄色显示，P环W藍色显示并指出C端凸起和N端凸起。由突变或删除祀向的 残基W红色突出显示。Del-1突变祀向密码子746-750的残基化REA。突变定位在激酶内高 度保守的区域中并发现于P环和激活环中，其包围着ATP并且也是gefitinib和erlotinib 预测结合的区域。
[0067] 图8A-8F.来自正常组织和来自肿瘤组织的EGFRDNA的代表性色谱。鉴定的突变 的定位如下。图8A描绘了外显子18激酶结构域P环（SEQIDN0S704-705)。图8B描绘 了外显子21激酶结构域A-环（SEQIDN0S706-707)。图8C描绘了外显子19激酶结构 域De^USEQIDN0S708-710)。图 8D描绘了外显子 19 激酶结构域De^3(SEQIDN0S 711-713)。图8E描绘了外显子19激酶结构域De^4(SEQIDNOS714-716)。图8F描绘了 外显子19激酶结构域De^5(SEQIDNOS717-719)。
[006引图9 ;EGFR和BCR-ABL多肤的序列比对和赋予药物耐受性表型的残基的定位。将由GenBank编号NM005228中公开的核巧酸编码的EGFR多肤（SEQ ID NO ;492)和由GenBank 编号M14752中公开的核巧酸序列编码的BCR-A化多肤（SEQ ID N0;491)进行比对并用阴 影标注保守性残基。通过星号表示赋予对酪氨酸激酶抑制剂imatinib(STI571，Glivec/ Gleevec)耐受性的BCR-ABL突变。
[0069] 图10显示对于患有转移性NSCLC患者来说决定进行EGFR测试的过程。
[0070] 图11EGFR外显子18-24的图（未给出比例尺）。箭头描述了鉴定突变的定位。星 号表明在每个位置上具有突变的患者的数目。单相交图描绘了外显子19删除的重叠，W及 具有每个删除的患者的数目（如图5所示的的核巧酸2233-2277和SEQIDNO;512的残基 745-749)。注意该些结果并没有包括目前所有的EGFR突变。
【具体实施方式】
[0071] 本发明提供一种确定在受癌症影响的人类患者中表皮生长因子受体巧GFR)祀向 性治疗有效的可能性的新方法。该方法包括检测所述患者的erbBl基因的激酶结构域中的 至少一种核酸变异的存在或缺失。至少一种变异的存在表示EGFR祀向性治疗可能有效。优 选地，所述核巧酸变异提高EGFR的激酶活性。随后可W用EGFR祀向性治疗来治疗所述患 者。在本发明的一个实施方案中，所述EGFR祀向性治疗是酪氨酸激酶抑制剂。在优选的实 施方案中，所述酪氨酸激酶抑制剂是苯氨基嗟挫咐。所述苯氨基嗟挫咐可W是合成的苯氨 基嗟挫咐。优选地，所述合成的苯氨基嗟挫咐为gefitinib或erlotinib。
[007引定义；
[0073] 术语"ErbBl"，"表皮生长因子受体"，和"EGFR"在本文中相互交换使用 并指如，例如，在Ca巧enter等Ann.Rev.Biochem. 56 ;881-914(1987)中公开的天然序列 EGFR，包括其变体（例如如在Hump虹巧等PNAS(USA)87 ;4207-4211 (1990)中的删除突变 EGFR)。ErbBl指编码EGFR蛋白产物的基因。
[0074] 本文所用的术语"提高激酶活性的核巧酸变异"指基因的核巧酸序列中的变异 (即突变），其导致提高的激酶活性。提高的激酶活性是在所述核酸中的变异的直接结果并 且所述基因编码的蛋白质相关联。
[0075] 本文所用的术语"药物"或"化合物"指施用给个体W治疗或预防或控制疾病 或状况的化学实体或生物学产品，或化学实体或生物学产品的组合。优选地，但并非必需 地，所述化学实体或生物学产品是低分子量化合物，但是也可W是较大的化合物，例如， 核酸的寡聚体，氨基酸，或糖类，包括但不限于蛋白质，寡核巧酸，核酶，DNA酶，糖蛋白， siRNAs，脂蛋白，适体，及其改进和组合。
[0076] 在本发明的背景中术语"基因型"指基因的特定等位形式，其可W用在特定位点 存在于核酸序列中的特定核巧酸来定义。
[0077] 术语"基因的变异形式"，"基因的形式"，或"等位基因"指基因在群体中的 一种特定形式，所述特定形式与相同基因的其它形式在所述基因序列中的至少一个，经常 是大于一个变异位点的序列上有所不同。在基因的不同等位基因之间差异的该些变异位点 上的序列称作"基因序列变异"或"变异"或"变体"。本领域已知的其它等同术语包括 突变和多态性，尽管突变经常用来指与有害表型相关联的等位基因。在本发明的优选方面， 所述变异选自由本文变异表中所列出的变异。
[0078] 在本发明的背景下，术语"探针"指能够可检测地区分结构不同的祀分子的分 子。根据所用探针的类型和祀分子的类型，检测可多种不同方式实现。因而，例如，检 测可W基因祀分子的活性水平的区别，但优选基于特异性结合的检测。该种特异性结合的 例子包括