物，按照1:5的比例 (重量：体积）加入PBS，反复冻融3次，离心取上清，0. 22iim滤膜过滤，滤液中加入终浓度 为20iig/ml的胰酶，37°C处理1. 5小时。
[0036] 按常规方法接种长满单层的ST细胞，按照10%的比例接种病毒，37°C吸附1小时， 补足细胞维持液(含l〇Kg/ml的胰酶)，37°C温箱培养。如此操作盲传至第8代时细胞出现 轻微的CPE变化，传至第17代时则出现明显、稳定的CPE变化，细胞圆缩，颗粒增加，聚堆呈 葡萄串样，细胞出现损伤和脱落（图7)。
[0037] 参考行业标准SN/T1446-2010中反转录聚合酶链式反应方法进行（S0P)。 即根据S基因设计检测引物对：S-F:5' -TAITTGTGGTYITGGTYGTAATGC-3' ；S-R: 5' -GGCTGITTGGTAACTAAmRCCA-3'，以 95°C45S、50°C45S、72°CImin进行 32 个循环后， 72°C延伸5min。扩增S基因片段为886bp，结果见图8。
[0038] 将猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞上连续传代120代，并在此过程进行了克隆纯 化，然后继续在ST细胞上传代至165代。TGEV0RF3基因序列在第20代、40代、70代、100 代处于比较稳定的的状态，有个别碱基的变化，但没有改变氨基酸；而第125代开始0RF3基 因连同前面的间隔区序列出现81个核苷酸的缺失(起始密码子前30个核苷酸、后51个核 苷酸连续81个核苷酸缺失)，第125代、145代、165代稳定缺失81个核苷酸，结果如图9,序 列如SEQIDNo. 11所示。扩增0RF3序列的引物的引物为： 0RF3-F:AATTGAAAAAGTGCACGTCC-3 ' 0RF3-R:CAACAGGAACCAGAAAAATGA-3， 按现行《中国兽药典》附录对第125~165代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检验，结 果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。将125~165代致弱株种毒命名为猪传染性胃肠炎 病毒HB08株，其保藏编号是CGMCCNo. 7807 ;保藏时间是2013年6月28日；保藏单位：中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研究所。
[0039] 取TGEVHB08株第145代与细胞维持液按1:100的比例接种到已长满单层的ST 细胞上，置于37°C培养，待80%细胞出现病变时收获病毒，测定毒价，病毒含量为IO8TCID5tl/ ml，-20°C保存备用。
[0040] 实施例3TGEV-PEDV二联灭活疫苗制备 TGEV-PEDV二联弗氏完全佐剂疫苗：取上述TGEV和PEDV病毒液，等病毒量混合，加入 0. 3%的甲醛，置于37°C恒温培养箱24h进行灭活，期间摇动数次，加入等量的弗氏完全佐 齐U，用玻璃注射器进行乳化，制备成首免灭活疫苗，4°C保存备用。
[0041]TGEV-PEDV二联弗氏不完全佐剂疫苗：取上述TGEV和PEDV病毒液，等病毒量混 合，采用同样方式灭活后加入等量弗氏不完全佐剂，乳化，制备好的疫苗于4°C保存备用。
[0042] 实施例4卵黄抗体制备 1)免疫程序 免疫方式均为胸部肌肉分点注射，共免疫五次。首免、二免、三免均间隔两周，三免后一 个月四免，四免后两周五免。首次免疫ImlTGEV-PEDV二联弗氏完全佐剂疫苗，二免、三免 和四免均接种TGEV-PEDV二联弗氏不完全佐剂疫苗，剂量分别为分别为2ml、4ml和2ml， 五免接种2mlTGEV-PEDV二联病毒液。
[0043] 2)抗体效价测定 第五次免疫后1周开始每隔7日收集高免蛋，并利用琼脂扩散试验检测高免卵黄抗体 效价，待卵黄抗体效价> 1:64时收集卵黄。结果第五次免疫后2周，卵黄抗体效价逐渐上 升，第五次免疫后4周达到高峰，抗体效价为1:512,并维持8周以上。
[0044] 3)卵黄抗体的纯化 无菌条件下收集卵黄，先后加入2倍体积的PBS缓冲液（0. 01M，pH7. 2)和1/2体积氯 仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和35 %硫酸铵沉淀卵黄抗体，最后溶于与原 卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4°C透析24小时，即为提纯卵黄抗体。
[0045] 4 )纯化卵黄抗体浓度和效价的测定 利用蛋白质定量试剂盒，采用微量法测定纯化抗体的浓度，并采用琼脂扩散试验检测 纯化卵黄抗体的效价。卵黄经氯仿去脂后，再经硫酸铵盐析法纯化，测定纯化抗体的浓度为 8.86mg/ml。纯化的抗体效价为1:128。
[0046] 5)微生物学检测 将上述纯化的卵黄抗体按照《中国兽药典》进行微生物学检测，观察有无细菌生长。结 果无细囷生长。
[0047] 实施例5安全性检验 取健康小鼠20只，随机均分为2组，一组为试验组，灌服纯化的卵黄抗体lml，另一组 为对照组，灌服生理盐水lml，连续观察72h后剖检小鼠，观察心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏 等器官及消化道有无病理变化。
[0048] 结果试验组和对照组小鼠均未呈现异常症状，72h后对20只小鼠进行剖检，与对 照组相比，试验组小鼠肝脏、脾脏、心脏、肺脏、肾脏及消化道均未呈现任何病理变化，说明 所制备的卵黄抗体安全性较好。
[0049] 实施例6人工感染治疗试验 将30头刚出生未吃初乳的仔猪随机分成3组，每组10头，第1组第2组为试验组，即 卵黄抗体治疗组；第3组为空白对照组，即未进行治疗组。各组仔猪以传染性胃肠炎病毒强 毒Pl株(甘肃省畜牧兽医研究所提供第5代组织强毒)和流行性腹泻病毒强毒p55株(福建 省农科院提供第4代组织强毒）混合液攻毒（口服2ml)，两种病毒含量均达到1000XMID/ ml。当仔猪开始出现腹泻症状时，试验1组仔猪口服本发明提纯的卵黄抗体，每次2ml，每 天2次；试验2组仔猪口服由TGEV华毒弱毒株（H) +PEDV弱毒疫苗株CV777二联病毒(病 毒由哈尔滨兽医研究所赠送）制备的卵黄抗体(简称经典卵黄抗体)，每次2ml(卵黄抗体含 量与试验1组相同），每天2次；空白对照组肌肉注射生理盐水2ml。观察治疗效果，统计发 病及死亡情况。
[0050]攻毒后12~24h，所有仔猪均出现腹泻症状，试验1组在口服本发明卵黄抗体后腹 泻症状逐渐减轻，4~5日后全部恢复正常；试验2组在口服经典卵黄抗体后腹泻症状虽逐渐 减轻，但第二日即有两头猪死亡，5日后70%恢复正常；未采取治疗措施的空白对照组则全 部死亡,死亡率为100%,结果见表1,从表中可以看出本发明制备的卵黄抗体治愈率要高于 经典毒株制备的卵黄抗体。
【主权项】
1. 抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，其特征在于，以猪传染性 胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的二联灭活疫苗为免疫原，免疫产蛋鸡，再从卵黄中纯化 出卵黄抗体而成，其中，所述的猪传染性胃肠炎病毒为猪传染性胃肠炎病毒HB08株，其保 藏号为CGMCCNo. 7807,所述的猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，保藏号 CGMCCNo. 7806。
2. 如权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于，所述的二联灭活疫苗为弗氏完全佐剂 疫苗或弗氏不完全佐剂疫苗。
3. 权利要求1或2所述的卵黄抗体的制备方法，其包括如下步骤： 1) 制备猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV二联灭活疫苗：将猪传染 性胃肠炎病毒HB08株和猪流行性腹泻病毒ZJ08株病毒液等病毒量混合，加入0. 2~0. 5%的 甲醛，置于35°C~37°C恒温培养箱24h~36h进行灭活，加入等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完 全佐剂制备成猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二联弗氏完全佐剂疫苗或弗氏不完全佐剂 疫苗； 2) 动物免疫：免疫方式均为胸部肌肉分点注射，共免疫五次，首免、二免、三免均间隔 两周，三免后一个月四免，四免后两周五免，首次免疫ImlTGEV-PEDV二联弗氏完全佐剂疫 苗，二免、三免和四免均接种TGEV-PEDV二联弗氏不完全佐剂疫苗，剂量分别为分别为2ml 、4ml和2ml，五免接种2mlTGEV-PEDV二联病毒液； 3) 抗体效价测定：第五次免疫后1周开始每隔7日收集高免蛋，并利用琼脂扩散试验 检测高免卵黄抗体效价，待卵黄抗体效价达到1:64时收集卵黄； 4) 卵黄抗体的纯化：无菌条件下收集卵黄，先后加入2倍体积的PBS缓冲液（0. 01M， pH7. 2)和1/2体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和35%硫酸铵沉淀卵黄 抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4°C透析24小时，即为提纯卵黄抗体。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，将猪流行性腹泻病毒ZJ08株与细胞维持液 按1:5(Tl: 100的比例接种到已长满单层的ST细胞上，将猪传染性胃肠炎病毒HB08株与 细胞维持液按l:5(Tl: 100的比例接种到已长满单层的VeroE6细胞上,两种病毒均置于 35°C~38°C培养，待80%细胞出现病变时收获病毒，病毒量为彡107_°TCID5Q/ml。
5. 权利要求1或2所述的卵黄抗体在制备治疗猪传染性胃肠炎病毒和/或猪流行性腹 泻病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，其以猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的二联灭活疫苗为免疫原，免疫产蛋鸡，再从卵黄中纯化出卵黄抗体而成，其中，所述的猪传染性胃肠炎病毒为猪传染性胃肠炎病毒HB08株，其保藏号为CGMCC No.7807，所述的猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，保藏号CGMCC No.7806。本发明制备的卵黄抗体性状良好，安全，本发明制备的卵黄抗体人工感染治愈率达100%，明显高于经典毒株制备的卵黄抗体治愈率，临床病例治愈率93.0%，临床预防试验中可使试验猪的腹泻发生率降低17~24个百分点。CGMCC No. 780720130628CGMCC No. 780620130628
【IPC分类】A61P31-14, C07K16-10, A61K39-42, C07K16-02
【公开号】CN104788561
【申请号】CN201410022975
【发明人】侯艳红, 王贵华, 赵亚荣, 刘明明, 满坤, 于萍萍, 卢会英
【申请人】北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心, 福州大北农生物技术有限公司, 北京科牧丰生物制药有限公司, 北京大北农科技集团股份有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2014年1月17日