-碘尿嘧啶； 5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧 口定等等。
[0017] "核苷"指核酸组分，其包含与糖部分(核糖或脱氧核糖)、糖部分的衍生物、或糖部 分的功能等价物(例如碳环）共价连接的碱基或碱性基团(包含至少一个同素环、至少一个 杂环、至少一个芳基等等)。例如，当核苷包含糖部分时，碱基通常连接至该糖部分的1'位 置。如上所述，碱基可以是天然存在的碱基或非天然存在的碱基。示例性核苷包括核糖核 苷、脱氧核糖核苷、双脱氧核糖核苷和碳环核苷。
[0018] "核苷酸"指核苷的酯，例如核苷的磷酸酯，具有与核苷的糖部分的5'位置共价连 接的一个、两个、三个或更多个磷酸基。
[0019] 术语"多核苷酸"和"寡核苷酸"可互换使用。"寡核苷酸"是有时用于描述较短的 多核苷酸的术语。寡核苷酸可以包含对应于指定的核苷酸序列区域的至少6个核苷酸，例 如至少约10-12个核苷酸，或至少约15-30个核苷酸。
[0020] 如本文使用的，术语"野生型"指当从天然存在的来源分离时，具有该基因或等位 基因的特征的基因或等位基因。野生型基因或野生型等位基因是最常在群体中观察到的那 种，并且任意指定为基因或等位基因的"正常"或"野生型"形式。
[0021] 相比之下，术语"突变型"或"突变的"指当与野生型基因或等位基因相比较时，展 示序列中的修饰的基因或等位基因。术语"突变"指通常保守的核酸序列的核苷酸序列中 的变化，导致形成与正常(未改变的）或野生型序列不同的突变体形式。突变一般可以分成 两个一般类别，即碱基对置换(例如单核苷酸置换）和移码突变。后者允许一个到几个核苷 酸对的插入或缺失。
[0022] 术语"等位基因"指相差仅一个或几个碱基的两个序列。
[0023] 术语"互补的"或"互补性"在提及沃森-克里克碱基配对原则相关的多核苷酸的 反向平行链中使用。术语"完全互补的"或"100%互补的"指具有在反向平行链之间的所 有碱基的沃森-克里克配对的互补序列，即在多核苷酸双链体中的任何两个碱基之间不存 在错配。然而，即使在不存在完全互补性的情况下，在反向平行链之间也形成双链体。术语 "部分互补的"或"不完全互补的"指反向平行多核苷酸链之间小于100%完全的任何碱基比 对(例如，在多核苷酸双链体中存在至少一个错配或未配对碱基)。部分互补链之间的双链 体一般比完全互补链之间的双链体更不稳定。
[0024] 术语"样品"指含有或推测含有核酸的任何组合物。这包括分离自个体的组织或流 体样品，例如皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪、血细胞、器官和肿瘤，并且还包 括由取自个体的细胞建立的体外培养物样品，包括福尔马林固定的石蜡包埋组织（FFPET) 和由其分离的核酸。
[0025] 术语"基本序列"指多核苷酸或寡核苷酸中的核苷酸序列。核苷酸修饰例如含氮 碱基修饰、糖修饰或其他主链修饰不是基本序列的一部分。标记物例如与寡核苷酸缀合的 生色团也不是基本序列的一部分。因此，两个寡核苷酸可以共享相同基本序列，但就修饰和 标记物而言不同。
[0026] 术语"引物"指这样的寡核苷酸，其与靶核酸中的序列杂交，并且能够在适合于此 类合成的条件下充当沿核酸互补链的合成起始点。如本文使用的，术语"探针"指与靶核酸 中的序列杂交且通常被可检测标记的寡核苷酸。探针可以具有修饰，例如使得探针无法通 过核酸聚合酶延伸的3'末端修饰，以及一种或多种生色团。具有相同序列的寡核苷酸可以 充当一个测定中的引物和不同测定中的探针。
[0027] 如本文使用的，术语"双功能接头分子"指可以通过与两种或更多种另外化合物 同时化学相互作用，将它们连接在一起的化合物。在本发明中，例如，双功能接头分子可以 具有适合于偶联至标记物例如荧光染料的一个功能结构域，以及能够偶联至寡核苷酸的5' 末端位置、3'末端位置或内部位置的另一个功能结构域或其他功能结构域。在本发明中，双 功能接头分子可以例如包含L-苏糖醇。能够将标记连接到寡核苷酸的内部位置内的多种 双功能接头分子已在美国专利号5, 585, 481、美国专利号6, 130, 323和Nelson等人，Nucl. Acid.Res. 20: 6253-6259,1992 中描述。
[0028] 如本文使用的，术语"靶序列"、"靶核酸"或"靶"指待扩增、检测或两者的核酸序 列的一部分。
[0029] 术语"杂交的"和"杂交"指两个核酸之间的碱基配对相互作用，其导致双链体形 成。它不要求两个核酸在其全长上具有100%互补性，以实现杂交。
[0030] 术语"选择性杂交"和"特异性杂交"指核酸占优势地(杂交分子的50%或更多）或 几乎唯一地(杂交分子的90%或更多）与复杂混合物中存在的特定核酸杂交，在所述复杂混 合物中还存在其他核酸。例如，在典型PCR条件下，引物与靶核酸特异性杂交，以排斥溶液 中也存在的非靶核酸。特异性杂交的引物驱动靶核酸的扩增，以产生靶核酸的扩增产物，其 至少是最占优势的扩增产物，并且优选是几乎唯一的(例如代表样品中所有扩增产物的90% 或更多）扩增产物。优选地，非特异性扩增产物以如此少量存在，使得它是无法检测的，或 以如此少量检测到，以便可容易地区别于特异性扩增产物。类似地，探针与靶核酸特异性杂 交，以排斥反应混合物中也存在的非靶核酸。特异性杂交的探针允许靶核酸的特异性检测， 以生成可检测信号，其至少是最占优势的信号，并且优选是几乎唯一的(例如代表样品中所 有扩增产物的90%或更多）信号。
[0031] 等位基因特异性探针 等位基因特异性杂交依赖于下述：通过使对于变体序列之一特异性的寡核苷酸与得自 扩增核酸样品的扩增产物杂交，区别相差至少一个碱基的两个DNA分子。等位基因特异性 测定还可以包含两个等位基因特异性寡核苷酸，例如用于第一变体的等位基因特异性探针 和针对第二变体的等位基因特异性探针，其中相对于另一种，探针与一种变体区别地杂交。 等位基因特异性杂交通常采用短寡核苷酸，例如长度15-35个核苷酸。设计此类探针的原 则和指导是本领域可获得的。杂交条件应足够严格，使得在等位基因之间的杂交强度中存 在显著差异，并且优选基本上是二元应答，由此探针与等位基因中的仅一个杂交。一些探针 设计为与靶DNA区段杂交，使得目的位点与探针的中心位置比对，但该设计并不需要。
[0032] 等位基因的量和/或存在通过测量与样品杂交的等位基因特异性探针的量进行 测定。通常，寡核苷酸用标记物例如荧光标记进行标记。例如，在导致与等位基因优先杂交 的杂交条件下，对于靶核酸的等位基因特异性的等位基因特异性探针与得自生物样品的核 酸杂交。测量荧光强度以测定特异性寡核苷酸是否已杂交。
[0033] 在单个核苷酸多态性位点处存在的核苷酸通过在足够严格的杂交条件下与寡核 苷酸杂交进行鉴定，所述寡核苷酸在涵盖多态性位点的区域中与等位基因基本上互补，并 且在该位点处与靶等位基因确切互补。在此类足够严格的杂交条件下，稳定双链体仅在探 针和靶等位基因之间形成。这些探针寡核苷酸可以为长度约10 -约35个核苷酸，优选长 度约15 -约35个核苷酸。
[0034] 基本上而不是确切的互补寡核苷酸的使用在测定形式中可能是期望的，在所述测 定形式中杂交条件的最佳化是有限的。例如，在多靶固定探针测定形式中，将每种靶的探针 固定到单个固体支持物上。通过使固体支持物与含有靶DNA的溶液接触同时进行杂交。因 为所有杂交均在相同条件下进行，所以杂交条件不能对于每种探针分开最佳化。当测定形 式妨碍调整杂交条件时，将错配掺入探针内可以用于调整双链体稳定性。特定引入的错配 对双链体稳定性的作用是众所周知的，并且双链体稳定性可以照常规进行评估和凭经验进 行测定，如上所述。取决于探针的确切大小和序列的合适杂交条件可以使用本文提供的指 导经验性地选择并且是本领域众所周知的。寡核苷酸探针检测序列中的单个碱基对差异的 用途在例如Conner等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:278-282,以及美国专利 号 5, 468, 613 和 5, 604, 099 中描述。
[0035] 完全匹配和单碱基错配的杂交双链体之间的稳定性中的变化比例取决于杂交寡 核苷酸的长度。由较短的探针序列形成的双链体由于错配的存在按比例地更失稳。在实践 中，长度约15 -约35个核苷酸的寡核苷酸对于序列特异性检测是优选的。此外，因为杂交 寡核苷酸的末端由于热能而经历连续的随机解离和再退火，所以在任一末端处的错配使杂 交双链体失稳小于内部发生的错配。优选地，为了区别靶序列中的单碱基对变化，选择与靶 序列杂交的探针序列，使得突变位点