在探针的内部区域中出现。
[0036] _核酸酶测定 靶核酸的检测可以使用"TaqMan? "或" 5 '-核酸酶测定"来执行，如美国专利号 5, 210, 015 ;5, 487, 972;和 5, 804, 375;以及Holland等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci. USA88:7276-7280中所述。在TaqMan?测定中，在扩增区内杂交的标记的检测探针在扩增 反应期间存在。这样修饰探针，以便阻止探针充当DNA合成的引物。使用具有5'至3'外 切核酸酶活性的DNA聚合酶执行扩增。在扩增的每个合成步骤期间，与待延伸的引物下游 的靶核酸杂交的任何探针被DNA聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性降解。因此，新靶链的 合成也导致探针降解，并且降解产物的累积提供了靶序列合成的量度。
[0037] 任何适合于检测降解产物的方法均可用于5'核酸酶测定中。通常，检测探针用两 种荧光染料进行标记，所述荧光染料之一能够猝灭另一染料的荧光。染料附着至探针，通 常报道或检测染料附着至5'末端，并且猝灭染料附着至内部位点，使得当探针处于非杂交 状态时猝灭发生，并且使得通过DNA聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性的探针切割在两种 染料之间发生。扩增导致探针在染料之间的切割，伴随猝灭的消除和可由初始猝灭的染料 观察到的荧光增加。降解产物的累积通过测量反应荧光中的增加进行监控。美国专利号 5, 491，063和5, 571，673描述了用于检测探针降解的替代方法，所述探针降解伴随扩增而 发生。
[0038] 用于检测靶核酸的5'核酸酶测定可以采用具有5'至3'外切核酸酶活性的DNA 聚合酶。因此，在一些实施方案中，具有5'核酸酶活性的聚合酶是热稳定和热活性的核 酸聚合酶。此类热稳定的聚合酶包括但不限于来自真细菌栖热菌属（热袍菌 属和栖热腔菌属（TXerfflosiMo)的多个物种的天然和重组形式的聚合酶， 以及其嵌合形式。例如，可以用于本发明方法中的栖热菌属物种聚合酶包括水生栖热菌 iThermusaquaticus)iTaq)观k聚；槪、鳴热敏热魯iThermusthermophilus)iTth) DNA聚合酶、栖热菌属物种Z05 (Z05)DNA聚合酶、栖热菌属物种spsl7 (spsl7)和栖热菌 属物种Z05(例如美国专利号5, 405, 774 ;5, 352, 600 ;5, 079, 352 ;4, 889, 818 ;5, 466, 591 ; 5, 618, 711 ;5, 674, 738和5, 795, 762中描述的）。可以用于本发明的方法中的热袍菌属 聚合酶包括例如海栖热袍菌（DNA聚合酶和新阿波罗栖热袍菌 (DNA聚合酶，而可以使用的栖热腔菌聚合酶的例子是非洲栖热 腔菌（a/rica/ws) DNA聚合酶。海栖热袍菌和非洲栖热腔菌DNA聚合酶的序 列公开于国际申请栖热腔菌中。新阿波罗栖热袍菌的序列可以在国际申请W0 97/09451中 发现。
[0039] 在5'核酸酶测定中，扩增检测通常与扩增同时（S卩，"实时")。在一些实施方案中， 扩增检测是定量的，并且扩增检测是实时的。在一些实施方案中，扩增检测是定性的(例如， 靶核酸的存在或不存在的终点检测)。在一些实施方案中，扩增检测在扩增之后。在一些实 施方案中，扩增检测是定量的，并且扩增检测在扩增之后。
[0040] 探针可以用任何数目的标记物进行标记，但通常为荧光标记物。在一些实施方案 中，焚光团部分选自焚光素家族染料、聚卤素焚光素（polyhalofluorescein)家族染料、六 氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、花青素家族染料、噁嗪家族染料、噻 嗪家族染料、方酸菁家族染料、螯合的镧系元素家族染料、偶氮家族染料、三苯甲烷家族染 料和B0DIPY?家族染料。
[0041] 测定通常包含由荧光标记物和猝灭剂部分标记的探针。在一些实施方案中，猝灭 剂部分选自荧光素家族染料、聚卤素荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染 料、罗丹明家族染料、花青素家族染料、噁嗪家族染料、噻嗪家族染料、方酸菁家族染料、螯 合的镧系元素家族染料、B0DIPY?家族染料、偶氮家族染料；三苯甲烷家族染料、低荧光猝 灭剂部分（即"低暗供体（dimdonors)"）和非荧光猝灭剂部分(例如所谓的"黑暗猝灭剂"， 包括BlackHoleQuenchers?(BHQ))〇
[0042] 罗丹明衍生的染料 罗丹明是含有如图1A中所示的核心结构的荧光染料。几种罗丹明衍生物，例如羧基 四甲基罗丹明（TAMRA)和磺酰罗丹明101酰基氯(德克萨斯红）也是荧光染料，通常用于 成像目的。其荧光发射最大值在600nm范围内的新型罗丹明衍生物已公开于美国专利号 6, 184, 379，（'379)。这些衍生物具有可以由下式表示的结构：
【主权项】
1. 一种制备用作PCR反应中的杂交探针的标记的寡核苷酸的方法，其包括： (a) 提供罗丹明衍生物荧光染料，其中所述荧光染料附着有双功能接头分子； (b) 经由双功能接头分子使反应基团与荧光染料键合，用于将所述荧光染料掺入寡核 苷酸内； (c) 将所述荧光染料掺入所述寡核苷酸的两个内部核苷酸之间，前提是所述荧光染料 不掺入所述寡核苷酸的5'末端处。
2. 权利要求1的方法，其中所述荧光染料是具有通式的化合物：
其中Ca、Cb、Cc和Cd各自指示C原子，Ca和Cb通过单键或双键连接在一起，并且Cc 和Cd通过单键或双键连接在一起； 父1、父2、父3、父4、父7和父10是氢，并且父5、父6、父8、父9、父10、父11和父12是甲基； Rl和R2是相同的或不同的，并且选自氢和具有1-20个C原子的烷基，其中烷基残基任 选由至少一个羟基、卤素、磺酸、氨基、羧基或烷氧基羰基基团取代，并且至少Rl含有可活 化基团； A1、A2、A3、B1是氯或氟，并且B2是氯、氟或氢。
3. 权利要求2的方法，其中所述荧光染料是：
4. 权利要求1的方法，其中所述双功能接头分子包含L-苏糖醇。
5. 权利要求1的方法，其中所述标记的寡核苷酸进一步包含在所述标记的寡核苷酸的 5'末端处附着的猝灭剂分子。
6. -种用于检测测试样品中的靶核酸或核酸的靶等位基因的存在或不存在的方法，其 包括： 使用与靶核酸杂交的标记的探针寡核苷酸执行PCR反应，其中所述标记的探针寡核苷 酸的特征在于具有： 罗丹明衍生物荧光染料，所述罗丹明衍生物附着有双功能接头分子；和 与所述双功能接头分子键合的反应基团，用于将所述荧光染料掺入所述寡核苷酸的两 个内部核苷酸之间，前提是所述荧光染料不掺入所述寡核苷酸的5'末端处； 检测来自所述荧光染料的信号，其中所述信号的强度代表所述靶核酸的存在或不存 在。
7. 权利要求6的方法，其中所述荧光染料是具有通式的化合物：
其中Ca、Cb、Cc和Cd各自指示C原子，Ca和Cb通过单键或双键连接在一起，并且Cc 和Cd通过单键或双键连接在一起； 父1、父2、父3、父4、父7和父10是氢，并且父5、父6、父8、父9、父10、父11和父12是甲基； Rl和R2是相同的或不同的，并且选自氢和具有1-20个C原子的烷基，其中烷基残基任 选由至少一个羟基、卤素、磺酸、氨基、羧基或烷氧基羰基基团取代，并且至少Rl含有可活 化基团； A1、A2、A3、B1是氯或氟，并且B2是氯、氟或氢。
8. 权利要求7的方法，其中所述荧光染料是：
9. 权利要求6的方法，其中所述双功能接头分子包含L-苏糖醇。
10. 权利要求6的方法，其中所述标记的寡核苷酸进一步包含在所述标记的寡核苷酸 的5'末端处附着的猝灭剂分子。
11. 权利要求6的方法，其中所述靶核酸是载脂蛋白E基因。
12. 权利要求6的方法，其中核酸的靶等位基因是载脂蛋白E基因的334T/C等位基因 或472 T/C等位基因。
【专利摘要】本发明涉及用于生成用于PCR反应中以检测靶核酸的标记的寡核苷酸探针的方法，所述标记的寡核苷酸探针含有荧光罗丹明衍生的染料。
【IPC分类】C12Q1-68, C07H21-00
【公开号】CN104854121
【申请号】CN201380066880
【发明人】C.阿纳克莱托, T.布加万, N.肖恩布伦纳
【申请人】霍夫曼-拉罗奇有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2013年12月18日
【公告号】CA2894932A1, US20140178877, WO2014095952A1