簇毛麦6vs染色体特异性分子标记6vs-bh1及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种一种簇毛麦6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1及其用途，属于 分子生物学和遗传育种科学技术领域。
【背景技术】
[0002] 小麦白粉病是由小麦白粉菌（财應eria 5/7. iriiici)引起的真菌 性病害，是影响小麦生产的主要病害之一。培育抗病品种是规避小麦白粉病危害的最经 济、有效的途径，其关键是抗白粉病基因的发掘与利用。作为小麦抗白粉病育种的重要野 生资源，簇毛麦應VV，2/?=办=14)对已知小麦白粉菌生理小种表 现完全免疫或高抗，其抗病基因已被多个课题组成功转移到普通小麦背景。例如，陈佩度 课题组将来自英国剑桥植物园的簇毛麦6VS染色体携带的基因转移到小麦中，育成 小麦-簇毛麦T6VS. 6AL易位系，该易位系中的6VS能稳定遗传且对农艺的不利影响少，因 而作为抗性亲本被广泛应用于小麦抗白粉病育种，迄今已育成20多个品种，推广面积超过 5000 万亩（Cao A, Xing L，Wang X，Yang X，Wang W，Sun Y，Qian C，Ni J，Chen Y， Liu D and Chen P. Serine/threonine kinase gene Stpk-V, a key member of powdery mildew resistance gene Pm21, confers powdery mildew resistance in wheat. Proc Natl Acad Sci USA. 2011, 108: 7727-7732·)。前苏联簇毛麦种质 No. 1026 的 6VS 染 色体上携带的/?堪因导入到小麦中，创制了 T6VS. 6DL易位系（Pm97033等，Li H, Chen X, Xin ZY, Ma YZ, Xu HJ, Chen, XY and Jia X. Development and identification of wheat-Haynaldia villosa T6DL. 6VS chromosome translocation lines conferring resistance to powdery mildew. Plant Breeding. 2005, 124: 203-205·)，目前也已进 一步育成扬麦22等抗白粉病品种。
[0003] 易位系T6VS. 6AL (/?泛7基因）和易位系T6VS. 6DL ( /?堪因）都具有广谱高效 的白粉病抗性，在生产上具有重要的应用价值，而开发6VS染色体特异性分子标记对于 提高小麦抗白粉病育种效率具有重要意义。目前已公布了一些与6VS上抗白粉病基因 连锁的相关分子标记 0PT17 14QQ、0PT17脚、SCAR14QQ、SCAR1265、NAU/XiBaol6 1586和 NAU/ XiBaol5902 (Cao, A. Z. , X. E. Wang, Y. P. Chen, X. ff. Zou, and P. D. Chen, 2006: A sequence-specific PCR marker linked with Pm21 distinguishes chromosomes 6AS, 6BS, 6DS of Triticum aestivum and 6VS of Haynaldia villosa. Plant Breeding 125, 201-205.)。但是，总体而言，这些标记在标记辅助选择育种中大多存在不稳定的缺点，一个 原因是由标记类型决定的，如RAH)标记0PT17 14(?和0PT17 其次是由于PCR反应体系和 反应条件要求苛刻，PCR结果可重复性差造成的。这些缺点均不利于标记辅助选择技术在 小麦育种实践中的应用。此外，绝大多数分子标记不能在小麦背景中同时区分基因和 /?堪因，难以在这两个基因的聚合育种中应用。
[0004] 前人在开发分子标记时，大多借助已经定位于基因组物理图上的EST (expressed sequence tag,表达序列标签)序列设计引物（陈升位，陈佩度.簇毛麦6VS染色体短臂特 异性EST标记的开发及缺失定位.麦类作物学报.2010，30(5):798-795.)。但定位在目 标染色体区域的EST数量有限，能开发的分子标记也有限。
[0005] 簇毛麦泣因是位点的关键成员之一，在基因介导的抗白粉病 过程中发挥中重要作用。本发明借助麦类作物-二穗短柄草比较基因组学，利用二穗短柄 草洞源基因附近的序列搜索小麦基因组中的同源序列，开发分子6VS特异性分子标 记，用于快速检测和追踪普通小麦遗传背景中不同来源的6VS易位染色体及其控制的抗白 粉病性状，为小麦抗白粉病分子标记辅助选择育种提供新型、实用、高效的分子标记。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法。
[0007] 本发明利用比较基因组学原理，围绕簇毛麦抗白粉病基因 (GeneBank登 录号：ΗΜ241655)在二穗短柄草中的同源基因开发分子标记，即利用物理位置与二穗短柄草 時目近的序列搜索小麦基因组中的同源序列，设计特异性引物，筛选簇毛麦6VS染色 体特异性分子标记，为抗白粉病小麦-簇毛麦T6VS. 6AL易位系在小麦抗白粉病新品种培育 中的应用提供一种新型、实用、高效的分子标记辅助选择技术。
[0008] 本发明筛选到的6VS染色体特异性分子标记6VS-BH1的引物如下： 6VS-BH1F :5' - GCCATTATAGTCAAGAGTGCACTAGCTGT -3'（SEQ ID NO. 1)， 6VS-BH1R:5' - AGCTCCTCTCGTTCTCCAATGCT -3' （SEQ ID N0.2)。
[0009] 该分子标记用于追踪小麦6AS、6DS染色体；还用于在小麦背景中区分小麦-簇毛 麦易位系T6VS. 6AL (/?泛7基因）和易位系T6VS. 6DL ( /?堪因）中的6VS染色体；并且可 用于区分两个易位系是纯合体、还是杂合体。
[0010] 本发明还提供该分子标记的具体用法，如下： (1) PCR 反应体系：1〇μL 反应体系中含约 10-20ng 模板 DNA，1XPCR buffer，l. 5mmol Γ1MgCl2,200mmolΓ1dNTP，两条引物终浓度各为0.2μmolIΛ0.5U7? ?7DNA聚合酶，用无 菌蒸馏水补充反应体系至IOML ; (2) PCR反应程序：94°C预变性3分钟；94°C变性20秒，60°C _66°C退火30秒，72°C延 伸60秒，32个循环；72°C延伸5分钟；4°C保存； (3) PCR产物检测：PCR扩增产物经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染 色。
[0011] 本发明的有益效果： 本发明公布的分子标记6VS-BH1，具有退火温度宽泛（60°C -66