一致则认为菌株已纯化。
[0027] 将复筛得到的菌株纯化后，接种到固体种子培养基上，35_40°C下培养3-5d，切取 1平方厘米的菌苔接种到装有30-50mL液体种子培养基的三角瓶中，在160-180r/min转速 下37-40°C进行液体震荡培养。培养3-4d后，按照6-10% (v/v)的接种量，将液体种子接 种到液体发酵培养基中，在160-180r/min转速下40-45°C进行液体震荡发酵培养。发酵 培养3-5d，取发酵液1200r/min，IOmin离心后收集上清液测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活 性。选取两种酶活性均较高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高酶 活的既产耐高阿魏酸酯酶又产耐高温纤维素酶的产生菌株。纯化的菌株接种于PDA斜面培 养基上，4 °C保藏。
[0028] 固体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL，琼脂粉I. 5g，pH5. 0,121°C， 15min灭菌。
[0029] 液体种子培养基：PDA培养基99mL，无机盐营养液lmL。121°C，15min灭菌。
[0030] 液体发酵培养基：PDA培养基80mL，无机盐营养液lmL，蛋白胨lg，吐温80 0. 5mL， (NH4)2S04 lg，补充去离子水至 100mL。121°C，15min 灭菌。
[0031] 经上述筛选方法所得菌株，菌落在PDA平板上呈辐射状快速生长，初期菌丝表面 疏松、平坦，白色，因产生分生孢子而呈现淡绿色，以后逐渐增多，呈深绿色。菌丝层致密、较 厚，产孢丛束排列成同心轮纹状，菌落背面无色。在放大400倍的光学显微镜下观察，菌丝 体由具有横隔的分枝菌丝构成，孢子梗由菌丝直立生出，分枝繁复，近似直角伸出，对生或 互生，呈树枝状排列，孢子梗长5. 0-12. 0 μ m，中间宽2. 5-3. 7 μ m，基部宽L 5-3. 0。分生孢 子成簇着生于分生孢子梗的顶端。分生孢子球形或椭圆形，大小为3. 0-4. 5X2. 5-3. 8 μ m， 表面粗糙，布满小刺，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。对照《真菌鉴定手册》 和相关文献确定该菌株是深绿木霉（Trichodermaatroviride)。
[0032] 所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26在饲料原料降解中的应用，具体方法为：将干燥的玉米稻杆粉10g、麸皮 5g、硫酸铵lg、豆柏粉lg、硝酸铵0. 4g、NaClO. 5g、磷酸二氢钾0. 2g和MgSO40.0 5g混合，按 固液质量比1:1.3加入去离子水，再接种菌株（1'1'；[(3110(161'1]^31：1'〇￥；[1^(16)4吧26,26-30°0 培养10天。
[0033] 所述的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26在发酵麦麸制备阿魏酸中的应用，包括以下步骤：
[0034] 步骤1，将菌株（Trichoderma atroviride)AWS26孢子悬浮液接种到发酵培养基 中，30-35°C培养3-5d，中间翻曲2-3次；
[0035] 步骤2,在步骤1所得麸曲中加入去离子水，搅拌，置于震荡摇床100r/min、50°C浸 提211，过滤，800017 /1^11离心201^11，取上清液用饱和度为80%(见14)2304盐析，4°〇静置过夜， 8000r/min离心20min，收集沉淀，用pH4. 0的磷酸-柠檬酸缓冲溶液溶解，得到耐高温阿魏 酸酯酶和耐高温纤维素酶混合粗酶；
[0036] 步骤3,将步骤2所得粗酶加入去淀粉麸皮，再加入水，调节pH4. 0,65°C酶解12h， 得阿魏酸。
[0037] 本发明提供的产耐高温阿魏酸酯酶和耐高温纤维素酶的深绿木霉，具有营养要求 低、繁殖快、发酵产物易于提取分离、发酵周期短的优点，且其发酵能够得到阿魏酸酯酶与 纤维素酶复合酶，该复合酶耐高温、酸碱稳定性好。
【附图说明】
[0038] 图1为本发明的深绿木霉初筛酶活检测平板图；
[0039] 图2为本发明的深绿木霉复筛酶活检测平板图；
[0040] 图3为实施例3中温度对阿魏酸酯酶与纤维素酶酶活性的影响曲线；
[0041] 图4为实施例3中pH值对阿魏酸酯酶和纤维素酶酶活性的影响曲线；
[0042] 图5为实施例3中复合酶制剂中阿魏酸酯酶和纤维素酶酶的热稳定性曲线；
[0043] 图6为实施例3中复合酶制剂中阿魏酸酯酶和纤维素酶pH稳定性曲线。
【具体实施方式】
[0044] 实施例1
[0045] 本实施例说明深绿木霉AWS26的筛选方法，具体步骤如下：
[0046] 步骤1，采样及样品处理：
[0047] 从江苏省徐州市云龙区大韩村正处于高温发酵的堆肥中取土样10份。称取固体 土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，160r/min振荡30min，制成悬 液，然后将此三角瓶放入60-70°C恒温震荡水浴锅中，lOOr/min震荡处理20-30min，得土样 浑浊液。
[0048] 步骤2,富集培养：
[0049] 吸取2-4mL步骤1所得土样浑浊液，加至装有30-60mL富集培养基一的容量为 250mL的三角瓶中，于45-50°C、转速160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d，得富集培养液。 无菌操作量取30-50mL富集培养液，4000-6000r/min离心5-10min，倒掉上清，用富集培养 基二将离心后的沉淀洗至装有30-60mL富集培养基二的250mL三角瓶中，于45-50°C、转速 160-200r/min的恒温摇床中培养5-7d。
[0050] 步骤3,初筛：
[0051] 将第二次富集后的培养液逐级稀释到ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟΛ取各级稀释的培养液 0. 2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿 口封好，并置于37-40°C恒温培养箱中倒置培养18-24h，然后将平板置于40-45°C恒温培 养箱中继续倒置培养2-4d。
[0052] 将平板上长出的菌落点种到两个初筛选择培养基的相同位置，两个初筛培养基分 别为阿魏酸酯酶初筛培养基和纤维素酶初筛培养基，接种好的培养皿40-45°C恒温培养箱 中倒置培养2-4d。待有明显菌落形成，观察阿魏酸酯酶初筛培养基上有无明显透明圈出现。 将纤维素酶初筛平板上加入一定量〇. 1 %的刚果红染液，染色Ι-lOmin，倒掉染色液，观察 菌落周围刚果红颜色是否明显变浅。将在两种初筛平板上均出现水解圈的菌株从阿魏酸酯 酶初筛培养基平板上接种出来，进一步复筛。阿魏酸酯酶和纤维素酶初筛平板检测结果分 别如表1和表2所不。
[0053] 步骤4,复筛：
[0054] 将步骤3初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于40-45 °C恒温培养箱中培 养2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化，所述 菌株初筛酶活检测平板图如图1所示。
[0055] 步骤5,菌种保藏：
[0056] 将复筛得到的菌株纯化后，接种到固体种子培养基上，35_40°C下培养3-5d，切取 1平方厘米的菌苔接种到装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在160-180r/ min转速下37-40°C进行液体震荡培养。培养3-4d后，按照6-10 % (v/v)的接种量，将液体 种子接种到液体发酵培养中，在160_180r/min转速下40-45°C进行液体震荡发酵培养。发 酵培养3-5d，取发酵液1200r/min，IOmin离心后收集上清液测定阿魏酸酯酶和纤维素酶酶 活性。选取两种酶活性均较高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高 酶活的既产耐高阿魏酸酯酶又产耐高温纤维素酶的产生菌株。纯化的菌株接种于PDA斜面 培养基上，4°C保藏。复筛结果如表3所示，综合考虑阿魏酸酯酶和纤维素酶的酶活情况，选 择菌株AWS26作为目的菌株。复筛所得菌株AWS26阿魏酸酯酶活性检测平板如图2所示，
[0057] 其中，所使用的培养基配方如下：
[0058] 富集培养基一：阿魏酸乙酯0. 2g、羧甲基纤维素钠 0. 5g，无机盐营养液lmL，补充 水至100mL，pH4. 5