Al-A-B-C和pDTA-iGb3S-A-B-C质粒大提后酶切验证 的电泳图；
[0084] 图5-1.为质粒pDTA-GGTAl-A-B-C重组ES细胞经探针1的Southern Blot确认 阳性克隆电泳图；
[0085] 图5-2.为质粒pDTA-iGb3S-A-B-C重组ES细胞经探针1的Southern Blot确认 阳性克隆电泳图；
[0086] 图6-1.质粒pDTA-GGTAl-A-B-C重组ES细胞经探针2的Southern Blot确认阳 性克隆电泳图；
[0087] 图6-2.质粒pDTA-iGb3S-A-B-C重组ES细胞经探针2的Southern Blot确认阳 性克隆电泳图；
[0088] 图7-1. GGTAl嵌合体小鼠照片；图7-2. iGb3S嵌合体小鼠照片；
[0089] 图8-1. GGTAl杂合子小鼠照片；图8-2. iGb3S杂合子小鼠照片；
[0090] 图9-1. GGTAl杂合子小鼠基因型鉴定高保真PCR引物设计图；
[0091] 图9-2. iGb3S杂合子小鼠基因型鉴定高保真PCR引物设计图；
[0092] 图10-1. GGTAl杂合子小鼠基因型鉴定高保真PC电泳图；
[0093] 图10-2. iGb3S杂合子小鼠基因型鉴定高保真PC电泳图；
[0094] 图11-1. GGTAl纯合子小鼠照片；图11-2. iGb3S纯合子小鼠照片；
[0095] 图12-1.剔除GGTAl基因纯合子小鼠基因型鉴定高保真PCR扩增基因片段的电泳 图；
[0096] 图12-2.剔除iGb3S基因纯合子小鼠基因型鉴定高保真PCR扩增基因片段的电泳 图；
[0097] 图13-1.剔除GGTAl基因的Southern blot筛选策略的示意图；
[0098] 图13-2.剔除iGb3S基因 Southern blot筛选策略的示意图；
[0099] 图 14-1.基因组DNA经GGTA15'Probel (探针 1)和 3'Probe2(探针 2)的 Southern Blot图；上图为探针1 ;下图为探针2 ;
[0100] 图 14-2.基因组DNA经 iGb3S 5'Probel (探针 1)和 3'Probe2(探针 2)的 Southern Blot图；a、b分别为探针1和探针2 ;
[0101] 图15-1. GGTAl/iGb3S双基因敲除杂合子小鼠基因组DNA经GGTAl高保真PCR检 测的电泳图；
[0102] 图15-2. GGTAl/iGb3S双基因敲除杂合子小鼠基因组DNA经iGb3S高保真PCR检 测的电泳图；
[0103] 图16. GGTAl和iGb3S纯合子及双基因敲除杂合子小鼠的mRNA表达检测结果图； a为GGTAl基因敲除纯合子小鼠 GGTAl基因的表达；b为iGb3S基因敲除纯合子小鼠 iGb3S 基因的表达；c为GGTAl/iGb3S及双基因敲除杂合子小鼠 iGb3S基因的表达；d为GGTAl/ iGb3S及双基因敲除杂合子小鼠 GGTAl基因的表达。
[0104] 图17.本发明制作基因敲除动物模型的流程示意图；
[0105] 本发明的【具体实施方式】仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构 成限制。
【具体实施方式】
[0106] 实施例1
[0107] 1、打靶载体的构建
[0108] I. 1从正常C57BL/6J小鼠分别分离GGTAl和iGb3S基因组DNA，然后采用PCR方 法分别扩增第9外显子第5外显子5'端CU A和3'端B、C2片段。
[0109] GGTAl打靶位点示意图如图1-1所示：基因序列选自C57BL/6J小鼠第2染色体基 因组 DNA(GRCm38.plC57BL/6J，NCBI Reference Sequence:NC_000068. 7)。剔除基因部分 位于外显子9,其长度为第9外显子催化区全长694bp加上5' (上游）端的246bp，全部长 度为940bp。本发明所用打靶载体长度为18. 966kb (图1-1)。
[0110] GGTAl克隆A片段的引物序列如SEQ NO ID:3和SEQ NO ID:4所示；
[0111] SEQ NO ID: 3 的核苷酸序列为：cgatGGTACCGATATCCGAGACCGCATAGTAAG ;
[0112] SEQ NO ID:4 的核苷酸序列为：cgatGAATTCCATATGTCGATGCCTGCCACACTG ;
[0113] iGb3S打靶位点示意图如图1-2所示：基因序列选自C57BL/6J小鼠第4染色体基 因组 DNA(GRCm38.plC57BL/6J，NCBI Reference Sequence:NC_000070. 6)。剔除基因部分 位于外显子5,其长度为第5外显子催化区全长687bp加上5' (上游）端的255bp，全部长 度为942bp。本发明所用打靶载体长度为25. 2kb (图1-2)。
[0114] iGb3S克隆A片段的引物序列如SEQ NO ID:5和SEQ NO ID:6所示；
[0115] SEQ NO ID:5 的核苷酸序列为：CGATGGTACCGATATCACAGAATCTTTCTCTGTTTTC ;
[0116] SEQ NO ID:6 的核苷酸序列为：CGATGAATTCCATATGCAGGGTTTCTCTGTGTAGCC ;
[0117] 扩增体系和条件如表1所示：
[0118] 表1:
[0119]
[0120] GGTAl克隆B片段的引物序列如SEQ NO ID:7和SEQ NO ID:8所示；
[0121] SEQ NO ID:7 的核苷酸序列为：cgatGGATCCCATATGCTTCAAATTGTGATGGAAACTTGA
[0122] SEQ NO ID:8 的核苷酸序列为：cgatGCGGCCGCGATATCAGCTTTTACAGACTGATGG
[0123] iGb3S克隆B片段的引物序列如SEQ NO ID:9和SEQ NO ID: 10所示；
[0124] SEQ NO ID:9 的核苷酸序列为：CGATGGATCCCATATGCAGCCCTTCCCTGGCCAAGC
[0125] SEQ NO ID:10 的核苷酸序列为：CGATGCGGCCGCGATATCCTGGTCACAGGAATGGCTTCA
[0126] 扩增体系和条件如表2所示：
[0127] 表2:
[0128]
[0129] 其中GGTAl克隆片段A和片段B的引物如表3所示：
[0130] 表3:
[0131]
[0132]
[0133] 其中iGb3S克隆片段A和片段B的引物如表4所示：
[0134] 表 4 :
[0135]
[0136] GGTAl克隆Cl片段的引物序列如SEQ NO ID: 19和SEQ NO ID:20所示；
[0137] SEQ NO ID:19 的核苷酸序列为：cgatCTCGAGATAATCACAAGCAAAGTGTCTGG
[0138] SEQ NO ID:20的核苷酸序列为：
[0139] CTATTAGGAGGATTGTTTACTTGATATCAGAAGAAGTACCAACACC
[0140] iGb3S克隆Cl片段的引物序列如SEQ NO ID:21和SEQ NO ID:22所示；
[0141] SEQ NO ID:21 的核苷酸序列为：CGATCTCGAGGTGGATGTCTCAGTGTGCGAA
[0142] SEQ NO ID:22的核苷酸序列为：
[0143] TACCGCAGACGGTGGATATCATTGACAGTCACTGAGCAA
[0144] 扩增体系和条件如表5所示：
[0145] 表 5 :
[0146]
[0147] GGTAl克隆C2片段的引物序列如SEQ NO ID:23和SEQ NO ID:24所示；
[0148] SEQ NO ID:23的核苷酸序列为：
[0149] GGTGTTGGTACTTCTTCTGATATCAAGTAAACAATCCTCCTAATAG
[0150] SEQ NO ID:24 的核苷酸序列为：cgatGCGGCCGCGAACACAAATGCCAGCCCAG
[0151] iGb3S克隆C2片段的引物序列如SEQ NO ID:25和SEQ NO ID:26所示；
[0152] SEQ NO ID:25 的核苷酸序列为：TTGCTCAGTGACTGTCAATGATATCCACCGTCTGCGGTA
[0153] SEQ NO ID:26 的核苷酸序列为：CGATGCGGCCGCCTATCGAGTGGTTATTCTCAGGG
[0154] 扩增体系和条件如表6所示：
[0155] 表 6 :
[0156]
[0157] 其中GGTAl克隆片段Cl和C2的引物如表7所示：
[0158] 表7:
[0159]
_I_I _I_I_I_
[0160] 其中iGb3S克隆片段Cl和C2的引物如表8所示：
[0161] 表 8 :
[0162]
[0163] 1. 2 连接到 pBlunt 载体：
[0164] 1. 2. 1分别将酶切鉴定、测序正确的A和B片段依次连接到pL452载体，得到 PL452-GGTA1-A-B 和 pL452-iGb3S-A-B。
[0165] 1. 2. 2分别通过Overlap PCR将测序正确的C1、C2片段融合连接到pDTA-Down载 体上，得到
[0166] pDTA-Down-GGTAl-C 和 pDTA-Down-iGb3S-C〇
[0167] L 2. 3 分别将连接正确的 pL452-GGTAl-A-B 和 pL452-iGb3S-A-B 用 EcoRV 酶切，回 收目的片段A-NeoR-B0
[0168] 在A片段的正向引物和B片段的反向引物上添加有EcoRV酶切位点，所以 PL452-AB可以用EcoRV将A-Neo-B片段切下来。
[0169] 1. 3分别将目的片段A-NeoR-B电转入含pBCTG的BAC菌进行重组：
[0170] 分别将切下来的A-Neo-B片段回收纯化，然后通过电转化的方法转入到含pBCTG 的BAC菌里面。
[0171] 1. 4分别进行菌落PCR检测A-NeoR-B片段重组BAC，鉴定扩增条带正确：
[0172] 分别在A和B片段两端设计合适的检测引物，检测引物的序列如表9、10所示；通 过AB两端的PCR来验证重组是否正确。
[0173] 表9:
[0174]
[
[
[0177] I. 5pDTA-down-GGTAl-C 和 pDTA-Down-iGb3S-C 的线性化处理：
[0178] EcoRV 酶切分别处理 pDTA-down-GGTAl-C 和 pDTA-Down-iGb3S-C，使其线性化，回 收目的条带，然后再通过电转化的方法将线性化条带分别转入到重组了 NeoR的BAC菌里。
[0179] I.6pDTA-GGTAl-C 拯救 GGTAl-NeoR BAC(AmpR+KanR)) :pDTA-iGb3S-C 拯救 iGb3S-NeoR BAC
[0180] (AmpR+KanR)：
[0181] 线性化后电转到重组了 NeoR的GGTAl的BAC菌里面后，通过同源重组的方式将 A-Neo-B 片段挺救到 pDTA-down-C 上；
[0182] 线性化后电转到重组了 NeoR的iGb3S的BAC菌里面后，通过同源重组的方式将 A-Neo-B 片段挺救到 pDTA-down-C 上。
[0183] 1.7分别对C拯救后的菌落进行PCR检测鉴定，将重组正确克隆进行扩增，在Cl和 C2两端设计合适的
[0184] 检测引物，通过PCR来验证重组是否正确，将重组正确的菌落摇菌过夜培养。
[0185] 检测引物的序列如表11所不：
[0186] 表 11-1 :
[0187]
[0188] 表 11_2 :
[0189]
[0190] 经转化Stb 13感受态细胞后，酶切验证如图3所示。
[0191] 酶切检测 pDTA-GGTAl-A-B-C :如图 3-1 所示；
[0192] MfeI：1705bp+2104bp+3582bp+5249bp+6326bp ；
[0193] Hindlll+EcoRI ：555bp+1129bp+6547bp+10735bp ；
[0194] S