其PCR扩增基因片段的电泳图如图12(其中图12-1为剔除GGTAl基因的电泳图，图12-2 为剔除iGb3S基因的电泳图）所示。
[0261] 纯合子尚保真PCR基因型筛选后，用探针1和探针2进彳丁 Southern Blot鉴定，确 认敲除基因的正确性和稳定性。Southern blot筛选策略的示意图如图13(其中图13-1为 剔除GGTAl基因的Southern blot筛选策略的示意图，图13-2为剔除iGb3S基因 Southern blot筛选策略的示意图），其中用短线标示出了 5'-Probel和3'-Probe 2的位点。所示探 针1和探针2的引物设计同表12 ;在5'端和3'端IoxP位点外侧分别引入两端的southern 酶切位点，分别用NdeI消化酶切，通过5'-Probe和3'-Probe的southern blot检测基因 敲除纯合子小鼠（Mut/Mut)只会产生突变型条带，杂合子小鼠（Mut/WT)会产生野生型和突 变型条带，而基因未敲除的野生型小鼠（WT/WT)只会产生野生型条带。各条带的大小见表 15。
[0262] 表15-1. GGTAl的Southern blot检测基因片段的大小
[0263]
[0264] 表15-2. iGb3S的Southern blot检测基因片段的大小
[0265]
[0266] Southern Blot合计检测6只小鼠（纯合子、杂合子和野生型各2只），提取鼠尾 基因组DNA。其Southern Blot鉴定结果分别如图14 (14-1为GGTAl的探针1(上部）和探 针2 (下部）的检测结果；14-2的a、b分别为iGb3S探针1、探针2的检测结果）所示，证实 了纯合子小鼠已经获得了稳定的遗传。
[0267] GGTAl和iGb3S双基因敲除小鼠杂合子的高保真PCR检测结果见图15,证实了 GGTAl和iGb3S单侧染色体变异的存在。
[0268] 6、表型鉴定
[0269] 本发明获得的GGTAl和iGb3S双基因敲除小鼠具有新的表型。一般生命指征正常， 生长发育正常。由于GGTAl和iGb3S双基因剔除动物模型商未见报道，其表型特征有待进 一步观察。
[0270] 模型小鼠基因表达水平表型鉴定采用mRNA表达的RT-PCR鉴定法。取GGTAl和 iGb3S纯合子及双基因敲除杂合子小鼠的多种脏器组织，包括肝、肺、肾、脾、心脏，进行 mRNA的表达测定。RT-PCR所用引物见表16 ;其检测结果见图16(其中图a为GGTA1K0小 鼠脏器组织GGTAlmRNA的验证结果；图b为iGb3S KO小鼠脏器组织iGb3S mRNA的验证结 果；图c为GGTAl KO和iGb3S KO双基因剔出杂合子小鼠脏器组织iGb3S mRNA的验证结果； 图d为GGTAl KO和iGb3S KO双基因剔出杂合子小鼠脏器组织GGTAlmRNA的验证结果）， GGTAl和iGb3S单独敲出小鼠完全失去了相应的mRNA的表达；双基因剔除的杂合子小鼠显 著降低了 GGTAl和iGb3S mRNA的表达。
[0271] 模型小鼠蛋白质表达水平表型鉴定采用alpha-Gal ELISA抑制法进行alpha-Gal 抗原表达的检测。alpha-Gal抗原的表达由GGTAl和iGb3S调控，GGTAl和iGb3S基因表 达的缺失将会导致alpha-Gal抗原表达的显著减少或者完全消失。alpha-Gal ELISA抑制 法采用alpha-Gal抗原的特异性抗体M86,先用M86与组织中的alpha-Gal抗原进行反应， 再进行离心分离未反应的剩余抗体；将剩余抗体通过alpha-Gal/BSA固相抗原包被96孔 板进行测定，以此计算与组织反应的alpha-Gal抗原的表达量。其检测结果见表17，GGTA1 和iGb3S基因剔出纯合子小鼠的alpha-Gal抗原的表达量较野生型小鼠（WT)相比均显著 减少。GGTAl是alpha-Gal的主要调控基因，因此GGTAl基因的剔出使得alpha-Gal的表 达降低了 52%~94% ;而iGb3S单独的基因缺失使得alpha-Gal的表达降低了 8. 8%~ 46. 6% ;GGTA1和iGb3S双基因剔出杂合子小鼠，较野生型小鼠相比显著减少了 Gal抗原的 表达。GGTAl和iGb3S双基因剔出纯合子小鼠将几乎完全消除alpha-Gal抗原的表达，这将 在国际上首次证明这一科学现象。
[0272] 表 16-1 :GGTA1 的 RT-PCR 引物序列
[0273]
[0274] 表 16-2 : iGb3S 的 RT-PCR 引物序列
[0275]
[0277] 表17-1 !GGTA1K0纯合子小鼠 alDha-Gal抗原的表达检测结果
[0278]
[0279] 表17-2 :iGb3S KO模型纯合子小鼠 alpha-Gal抗原的表达检测结果
[0280]
[0281] 表17-3 :GGTAl/iGb3S双基因敲除小鼠杂合子alpha-Gal抗原的表达检测结果
[0282]
[0283] 7、基因剔出动物的生命周期
[0284] GGTAl/iGb3S双基因敲除小鼠的生命周期与野生型动物无显著差异，未见生命周 期不同的报道。本发明中GGTAl/iGb3S双基因敲除基因剔除小鼠的生命周期尚未见缩短现 象，且一般状态正常。
【主权项】
1. 一种制备GGTAl和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括以下 步骤： (1) 构建打靶载体：分别从基因组DNA中分离GGTAl和iGb3S基因，经长链PCR方法扩 增获得同源臂，与抗生素耐药基因复合构建GGTAl打靶载体和iGb3S打靶载体； (2) 将GGTAl打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到 假孕动物体内，与正常动物交配；对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除 的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得GGTAl的Fl代杂合子； (3) 将iGB3S打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到 假孕动物体内，与正常动物交配；对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除 的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得iGB3S的Fl代杂合子； (4) 将GGTAl的Fl代杂合子和iGB3S的Fl代杂合子之间交配后获得两条染色体均被 剔出的GGTAl和iGb3S纯合子动物； (5) 再将GGTAl和iGB3S纯合子动物进行交配，筛选GGTAl和iGb3S同时缺失的双基因 敲除纯合子动物，并建系获得基因敲除动物种群。2. 根据权利要求1所述的制备GGTAl和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法，其 特征在于，所述的非人哺乳动物为小鼠，进一步优选C57BL小鼠。3.根据权利要求1所述的制备GGTAl和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法，其 特征在于，所述的GGTAl基因敲除为敲除GGTAl基因的功能性催化区第九外显子，其核苷酸 序列如SEQ NO ID: 1所示；所述的iGb3S基因敲除为敲除iGb3S基因的功能性催化区第五 外显子，其核苷酸序列如SEQ NO ID:2所示。4. 根据权利要求1所述的制备GGTAl和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法， 其特征在于，所述GGTAl打靶载体含有5'同源臂、耐药抗生素基因NeoR-PA和3'同源臂， 用NeoR-PA分别取代第9外显子；所述iGb3S打靶载体含有5'同源臂、耐药抗生素基因 NeoR-PA和3'同源臂，用NeoR-PA分别取代第5外显子。5. 根据权利要求1所述的制备GGTAl和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物、子代、胚 胎或细胞的方法，其特征在于，用于GGTAl打靶载体构建的耐药抗生素基因NeoR-PA5'端 和3'端的同源臂序列取自小鼠第二条染色体上GGTAl基因第9外显子的5'端和3'端，分 别为4. 123kb和7. 343kb;用于iGb3S打靶载体构建的耐药抗生素基因NeoR-PA5'端和3' 端的同源臂序列取自小鼠第四条染色体上iGb3S基因第5外显子的5'端和3'端，分别为 8. 3kb和 9.lkb。6. 根据权利要求2所述的制备GGTAl和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法，其 特征在于，构建打靶载体的步骤为： 其中，GGTAl打靶载体的构建步骤为： (1) 从正常C57BL/6J小鼠分离基因组DNA，扩增第9外显子5'端Cl片段、A片段和3' 端B片段、C2片段，分别连接到pBlunt载体； (2) 将酶切鉴定、测序正确的A和B片段依次连接到pL452载体得到pL452-GGTAl-A-B， 同时，通过OverlapPCR将测序正确的CUC2片段融合后连接到pDTA-Down载体上； (3) 将连接正确的pL452-GGTAl-A-B用EcoRV酶切，pL452-AB切出 2885bp、2930bp两 条带，回收目的片段A-NeoR-B，电转含pBCTG的BAC菌进行重组；菌落PCR检测A-NeoR-B片 段重组BAC，鉴定扩增条带正确； (4)pDTA-down-GGTAl-C的线性化处理，即EcoRV酶切处理pDTA-Down-GGTAl-C，回 收目的条带，电转已经重组了NeoR的GGTAl的BAC菌；pDTA-GGTAl-C拯救GGTAl-NeoR BAC(AmpR+KanR);对C拯救后的菌落进行PCR检测鉴定，将重组正确克隆进行扩增，经 Stbl3纯化后酶切验证； iGb3S打靶载体的构建步骤为： (1) 从正常C57BL/6J小鼠分离基因组DNA，扩增第5外显子5'端Cl片段、A片段和3' 端B片段、C2片段，分别连接到pBlunt载体； (2) 将酶切鉴定、测序正确的A和B片段依次连接到pL452载体得到pL452-iGb3S-A-B， 同时，通过OverlapPCR将测序正确的CUC2片段融合后连接到pDTA-Down载体上； (3) 将连接正确的pL452-iGb3S-A-B用EcoRV酶切，pL452-AB切出 2880bp、2885bp两 条带，回收目的片段A-NeoR-B，电转含pBCTG的BAC菌进行重组；菌落PCR检测A-NeoR-B片 段重组BAC，鉴定扩增条带正确； (4) pDTA-down-iGb3S-C的线性化处理，即EcoRV酶切处理pDTA-Down-iGb3S-C，回 收目的条带，电转已经重组了NeoR的iGb3S的BAC菌；pDTA-iGb3S-C拯救iGb3S-NeoR BAC(AmpR+KanR);对C拯救后的菌落进行PCR检测鉴定，将重组正确克隆进行扩增，经 Stbl3纯化后酶切验证。7. 根据权利要求1所述的制备GGTAl和iGb3S双基因敲除的非哺乳动物、子代、胚胎或 细胞的方法，其特征在于，步骤（2)包括以下步骤：制备不育雄鼠和假孕母鼠；超排卵；收获 受精卵；目的DNA的制备；将目的DNA导入受精卵；受精卵的移植；首建鼠中目的DNA整合 情况的检测；通过杂交繁育基因剔出小鼠种系。8. -种来自权利要求1所述的双基因敲除动物的精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组 织或细胞。9. 一种如权利要求1所述的双基因敲除的非人哺乳动物或如权利要求8所述的精子、 卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞在生物源性材料中的应用和在a-Gal抗原介导的 肿瘤免疫的应用；所述生物源性材料包括动物源性或取自人体的，所述的动物源性生物材 料不包括灵长类动物；所述的动物源性生物材料的种类包括取自动物体内的各种组织、脏 器及其衍生物，或者由组织或脏器制备的各种材料；所述的灵长类动物优选古世纪猴、狒 狒。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用包括在免疫学研宄、免疫毒 理学研宄、a-Gal抗原表达的调控机理研宄、异种移植的免疫排斥反应及其机理的研宄、安 全性评价中的应用；所述的免疫学研宄包括a-Gal抗原介导的异种动物组织、器官或动物 源性生物材料及肿瘤免疫的研宄；所述的安全性评价包括生物源性材料，优选动物源性生 物材料在临床实验研宄前的安全性评价和GGTAl基因敲除猪、牛等动物组织、器官移植的 免疫学评价。
【专利摘要】本发明涉及制作基因敲除动物模型的领域，具体讲，涉及一种制备GGTA1和iGb3S双基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用。其制备方法为：分别构建打靶载体；将打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假孕动物体内，与正常动物交配；对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得F1代杂合子；F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的GGTA1和iGb3S纯合子动物；再将GGTA1和iGb3S纯合子动物进行交配，筛选GGTA1和iGb3S同时缺失的双基因敲除纯合子动物，并建系获得基因敲除动物种群。
【IPC分类】C12N15/54, G01N33/53, C12N15/85, C12N5/10, A01K67/027
【公开号】CN104894163
【申请号】CN201510122581
【发明人】徐丽明, 邵安良, 范昌发
【申请人】中国食品药品检定研究院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月19日