秒。
[0128] 实施例4
[0129] 称取Ig样品，可根据样品的DNA含量，调整样品量，加入到50mL的离心管中；加入 5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大 的食品样品，加入CTAB提取液的量应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜 后，8000r/min室温离心10min，取Iml上清液入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振 荡，13000g离心10min，转移上清液600 μ L到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉 淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000 X g离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液 将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后 加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加 入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50 μ L TE溶液中。然后取1.0 μ L提取物加入到 以下反应体系，
[0130] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOuL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物ZeinF 0.5 μ L
[0131] 终浓度0.5 pmol/L的下游引物ZeinR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物CBH351 F 0.5 U L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物CBH351R 0.5 μ L DNA模版 IyL 水 补齐至20 μ L。
[0132] 其中引物序列如下：
[0133] 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT
[0134] 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG
[0135] 上游引物 CBH35IF :TATGTTACTAGATCGCAGAT
[0136] 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。
[0137] 进行荧光PCR扩增，按以下步骤进行：
[0138] (1)92°C~96°C预变性 30s ;
[0139] (2) 92°C~96°C变性5s~10s，55°C~65°C退火20s~40s，共进行35~45个循 环。
[0140] A、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
[0141] 对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
[0142] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0143] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0144] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至92°C~96°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0145] 本发明中标准DNA模版的制备：
[0146] 以常规PCR方法扩增耐药基因目的基因 ZEIN和CBH351。PCR产物经1 %凝胶电泳 分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T 连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养 基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测 序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0147] 结果分析
[0148] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且熔解曲线有一个特异性波 峰，Tm值为88. 23±0. 15°C，可判为玉米Zein基因检出。
[0149] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,熔解曲线有一个特异性波峰， Tm 值为 81.82±0. 15°C，可判为 CBH351 检出。
[0150] 如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值〈35,而且有两个波峰，Tm值分别为 82·51±0· 15°C和87·43±0· 15°C，可判为玉米Zein基因和CBH351均检出。
[0151] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显，35〈Ct值〈40,重复一次，如果仍有明显上升曲 线，则至少有一个目的基因为检出，同时根据前述熔解曲线分析图波峰发生情况和Tm值进 行相应判断。
[0152] 如果样品荧光PCR扩增曲线明显Ct值>40,或无明显扩增曲线和Tm值，判为玉米 Zein基因和CBH351均检测阴性。
[0153] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0154] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，采用〇. 1%标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到〇. 1%的检测阈值， 重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良 好的线性关系R 2多〇. 95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0155] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技 术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明 本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些 变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及 其等效物界定。
【主权项】
1. 一种检测转基因玉米CBH351的引物，其特征在于该引物的序列分别为： 上游引物 ZeinF :TTATGCTCCTTGGTCTTT 下游引物 ZeinR :GTAATAGGGCTGATGATTG 上游引物 CBH351F :TATGTTACTAGATCGCAGAT 下游引物 CBH351R :AAGGTCCAATAGTGTATGT。2. -种检测转基因玉米CBH351的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20 μ L反应体系包括 以下组分：其中所述上游引物ZeinF的序列：TTATGCTCCTTGGTCTTT 所述下游引物ZeinR的序列：GTAATAGGGCTGATGATTG 所述上游引物 CBH351F 的序列：TATGTTACTAGATCGCAGAT 所述下游引物 CBH351R 的序列：AAGGTCCAATAGTGTATGT。3. 根据权利要求2所述的一种检测转基因玉米CBH351的试剂盒，其特征在于该试剂盒 中20 μ L反应体系包括以下组分：4. 一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于包括以下步骤： A、提取样品DNA ; B、 利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增； C、 扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。5. 根据权利要求4所述一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于步骤B中PCR 扩增的反应程序按以下步骤进行： (1) 92°C ~96°C预变性 30s ; (2) 92°C~95°C变性 IOs ~30s，54°C~64°C退火 IOs ~30s，72°C IOs ~30s，共进行 35~45个循环； (3) 72°C延伸 IOs ~30s。6. 根据权利要求5所述一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于步骤C中所述 高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行： (1) 92°C~96°C变性 Imin ; (2) 40 °C 复性 Imin ; (3) 然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解过程 中实时检测荧光信号，15~25次/秒。7. 根据权利要求6所述一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于步骤A中所述 提取样品DNA的具体步骤如下： 称取Ig样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液， 充分混匀。65°C孵育30min，不时振荡；吸水性大的样品，加入CTAB提取液的量应根据液面 是否能盖住样品并多出少许而定；65°C过夜后，8000r/min室温离心10min，取Iml上清液 入2ml离心管中；加入700 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600 μ L到 新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000Xg 离心10min，弃去上清，加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μ L氯仿，涡旋 振荡进行混勾，13000g离心10min，转移上清后加入0. 8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室 温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于 50 μ L TE溶液中。
【专利摘要】本发明公开了检测转基因玉米CBH351的引物、试剂盒和方法，引物：ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT；下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG；上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT；下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。试剂盒：HRM反应预混液10μL；引物0.2-3.4μL；DNA模版1μL；水补齐至20μL。检测方法：提取样品DNA；利用试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。目的是提供一种用于检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的引物、试剂盒及方法，试剂盒：组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确；方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104894282
【申请号】CN201510362507
【发明人】蔡先全, 李蓉, 柏建山, 邱德义, 单振菊, 周思渝, 吴坚明, 萧绮倩, 邱霞
【申请人】蔡先全
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月25日