水处理为对照。然后提取处理过的样本1?^ 进行RT-PCR分析。结果发现UGT76E11基因的表达受盐胁迫和渗透胁迫的诱导。其中盐胁 迫处理3h后UGT76E11表达水平上调最明显，达到了对照的8倍左右。盐胁迫处理6h、12h， 表达水平上调5~6倍。
[0025] 实验结果说明UGT76E11基因在植物应对盐胁迫时可能发挥重要作用。
[0026] 实施例2拟南芥糖基转移酶基因 UGT76E11的耐盐性应用
[0027] 1.含有UGT76E11编码区cDNA表达载体的构建
[0028] PK76E11中间测序载体经过BamHI和Sal I双酶切后，获得带有酶切粘性末端的全 长cDNA序列。将此基因片段与用相应酶酶切后的pBI121载体部分相连，得到以CaMV 35S 启动子驱动糖基转移酶基因过表达的植物表达载体，称为PBI76E11。
[0029] 2.农杆菌介导植物转化
[0030] 农杆菌GV3101具有侵染植物和转移基因的能力，故将构建的UGT76E11植物表达 载体（PBI76E11)转入农杆菌，然后进行PCR验证和酶切验证。利用浸花法（一种公开的通 用方法），使含有植物表达载体的农杆菌GV3101浸染拟南芥花蕾。待其长出的角果成熟之 后，收集Tl代种子并在筛选培养基（MS培养基附加30mg/L卡那霉素）上进行筛选，将能 够正常生长的绿色转化苗移栽至营养土中培养，分别收获其T2代种子再进行下一轮的卡 那霉素筛选，挑选出绿苗：白苗为3 :1的培养皿。将此培养皿上的绿苗移栽，单株收获种子 (T3代）。对每一单株的种子部分用于卡那霉素平皿筛选，直到选出在筛选培养基上为全绿 的株系，即为纯合转基因株系。
[0031] 3.转基因植株分子鉴定
[0032] 对上述转基因植株进行基因表达水平的检测。分别提取转基因植株和野生型 植株的RNA，反转录后进行RT-PCR扩增，分析过表达植株和野生型植株的基因表达差异。 UGT76E11在过表达植株中的表达量都明显高于野生型植株。利用两个UGT76E11表达量高 的株系，即OE-69、OE-87,来进行后续的工作。其中OE-87株系的表达量高于OE-69。
[0033] 4. UGT76E11基因的耐盐性功能验证
[0034] (1)种子在含盐培养基上的萌发实验。WT为拟南芥对照植物，OE-69和OE-87为 UGT76E11的两个转基因过表达株系。MS(-)表示不含盐的培养基，125mM NaCl表示含有 125mM NaCl的MS培养基，其余类推。将拟南芥对照植物和过表达株系的种子点在含OMm NaCl、125mM NaCl和175mM NaCl的MS培养基上，连续7天统计萌发率。统计结果显示两个 过表达株系在含盐的培养基上，萌发率明显高于野生型对照。这说明UGT76E11基因过表达 之后明显增强了植株萌发期的耐盐性（见图1)。
[0035] (2)在含盐培养基上根的生长实验。WT为拟南芥对照植物，OE-69和OE-87为 UGT76E11的两个转基因过表达株系。MS(-)表示不含盐的培养基，IOOmM NaCl表示含有 IOOmM NaCl的MS培养基，其余类推。将拟南芥对照植物和过表达株系在MS (-)培养基上垂 直培养3天，然后转移到含不同浓度NaCl的MS培养基上。10天之后统计植株的根长。实 验结果显示在含盐培养基上，两个过表达株系的根长明显高于野生型。因为在株系OE-87 中UGT76E11的表达水平高于OE-69,株系OE-87表现出更强的根系生长。这说明UGT76E11 基因过表达之后能够增强植株的抗盐性（见图2)。
[0036] (3)伊文思蓝（Evans Blue)染色实验。伊文思蓝是一种常用的偶氮染料制剂，在 染色时因为有活性的细胞具有外排功能而无法被伊文思蓝染色，而死细胞可以吸收染色而 成蓝色，因此通过染色可以区分死细胞与活细胞。WT为拟南芥对照植物，0E-69和0E-87为 UGT76E11的两个转基因过表达株系。"Control"表示未经过盐水胁迫的叶片染色，"lOOmM NaCl"表示经过IOOmM NaCl胁迫处理的叶片进行染色，其余类推。将正常生长四周的拟南 芥对照植物和过表达株系分别浇含有IOOmM NaCL、200mM NaCL和300mM NaCL的盐水，以不 浇盐水的植物作为对照。处理12小时之后剪取大小相近的叶片，进行Evans Blue染色。实 验结果发现在盐胁迫处理以后，两个过表达株系的染色比野生型对照浅很多，说明过表达 株系经过盐处理之后细胞死亡比野生型对照少。证明UGT76E11基因可用于增强植物耐盐 性（见图3)。
[0037] (4)植物苗期浇盐水实验。WT为拟南芥对照植物，0E-69和0E-87为UGT76E11的 两个过表达株系。实验材料是正常生长2周的拟南芥对照植物和两个过表达株系。选取 生长状态一致的植株，先浇一次150mM NaCl的盐水，一周之后再浇一次200mM NaCl的盐 水，之后再浇250mM NaCl的盐水两周，每周一次。浇盐水之前转基因株系与对照生长状态 一致，浇盐水之后发现野生型对照几乎全部死亡（叶片变白），而两个过表达株系只有少量 叶片出现死亡，这说明UGT76E11基因过表达之后明显增强了植株的耐盐性（见图4)。
【主权项】
1. 拟南芥糖基转移酶基因UGI76E11在提高植物耐盐性中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述糖基转移酶基因UGI76E11的核苷酸序 列如SEQIDNo. 1所示。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物是十字花科植物。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物是拟南芥、油菜、白菜、甘 蓝或芥菜。
【专利摘要】本发明公开了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11在提高植物耐盐性中的应用，其中所述糖基转移酶基因UGT76E11的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其是通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆获得。本发明利用基因UGT76E11构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的耐盐性得到明显提高，预示本发明实施后将会创造新型耐盐植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。
【IPC分类】C12N15/54, A01H5/00, C12N15/84
【公开号】CN104928304
【申请号】CN201510376825
【发明人】侯丙凯, 李琴, 李燕洁
【申请人】山东大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年7月1日