进行PCR扩增考 察选取区域5hmC含量情况。PAX5基因是调控成熟B细胞功能的转录因子，并在人类肿瘤尤 其是血液系统肿瘤中存在染色体异位、异常高频突变、异常甲基化等形式的异常表达。从检 测结果上看（附图6a)，PAX5基因中存在大量5hmC，其中5hmC的生物学功能还不是十分清 楚。附图6b，化学标记-高通量测序结果显示选取的PAX5三个扩增区域的Peak值分别是 246, 798和1534,表明了 5hmC在PAX5基因不同区域富集具有显著性差异；选取的内部参考 基因 UTR-5_SRR的Peak值是13。附图6a和图6b，硼酸介导的聚合酶链反应结果显示选取 的PAX5三个扩增区域的Λ Ct分别是1. 5, 3. 6和7. 5, 5hmC的富集具有显著性差异；选取的 内部参考基因 UTR_5_SRR的Λ Ct值是0. 1。Tetl和Tet2双敲除和非糖基化样品Λ Ct值保 持不变。附图6b，对于小鼠胚胎干细胞基因组DNA的ΡΑΧ5基因5hmC的检测，硼酸介导的聚 合酶链法与化学标记-高通量测序法显著性相关（P=〇. 002 < 0. 01)，相关性系数0. 998。其 中，采用硼酸介导的聚合酶链反应检测INTRON_PAX5_3区域，此扩增区域的PCR扩增曲线、 熔解度曲线和PCR终产物的凝胶电泳谱图均表明2-CB-PBA的加入能够有效的抑制DNA聚 合酶扩增活性。
[0043] 在小鼠胚胎干细胞基因组DNA的高通量测序（Illumina ChIP-Seq，GSE43262)结 果中挑选20个5hmC的Peak区域，共包含9种基因(包括多潜能性相关基因 NAN0G、SMAD5、 S0X5和S0X6、基因组印记区域相关基因 DLK1、GLI3和神经营养因子相关基因 ALK、NTRK2); 在确定扩增区域之后，针对不同的基因设计特异性引物，然后将小鼠胚胎干细胞基因组DNA 依次进行葡萄糖基化和2-CB-PBA处理，采用设计的特异性引物进行PCR扩增。附图7显 示，经过葡萄糖基化和2-CB-PBA处理后的选定基因区域Ct值变化显著，Λ Ct值变化范围是 1. 0-7. 5,且未葡萄糖基化处理的对照组，Λ Ct值变化范围是-0. 6-0. 4,再次可以推断Ct值 的变化是2-CB-PBA处理和葡萄糖基化共同作用的结果，即通过检测5ghmC，实现了 5hmC的 鉴定分析。
[0044] 实施例2. 5hmC的定量分析
[0045] 以2-CB-PBA处理后的样品为例，将阴性对照探针（5hmC-dsIOOmer )和阳性对照探 针（5ghmC-ds100 mer)按照不同的比例进行混合，选择5ghmC :5hmC摩尔浓度比分别为：0:1、 1:16、1: 8、1: 4、1: 2、I: I、2:1、4:1和1:0,混合模板浓度保持在5. OnM。然后将此混合液作 为PCR扩增模板，考察5ghmC-dsIOOmer浓度与Λ Ct值之间的关系，从而能够通过PCR扩增 曲线Ct值的变化来对5ghmC进行定量分析。附图5a和图5b所示，随着5ghmC浓度增加， Λ Ct值从0增加到6. 0,且两者之间满足线性关系：Λ Ct=6. 14+4. 871og[5ghmC/ds100 mer] (R2=O. 97)。虽然Λ Ct值增加，PCR扩增产物量却在逐渐减少（附图5c)，这也说明了 2-CB-PBA 能够有效的抑制DNA聚合酶的复制。
[0046] 实施例3.硼酸介导的聚合酶链反应试剂盒与限制性内切酶结合PCR检测试剂盒 (即MspI酶解法）的比较
[0047] 限制性内切酶MspI识别CCGG序列，通过葡萄糖基化处理，导致其酶切特异性发生 改变：MspI识别并切割5mC和5hmC，但不能切割5ghmC ;当5ghmC位点处于CCGG序列上，即 将此前可以切割的5hmC位点转变为不可切割的5ghmC位点，从而通过PCR扩增使序列得以 保留。因此，限制性内切酶法受到了酶切位点等多种条件的限制。
[0048] 首先，以阳性对照探针（5ghmC-dS100mer )为PCR扩增模板，考察分别经过 2-CB-PBA处理和MspI酶解后PCR扩增情况。探针在经过MspI酶解后，Ct值没有发生明显 变化，即酶解处理不影响PCR扩增，这与合成探针中无 CCGG位点不满足酶切条件的情况相 符合；但是，模板经过2-CB-PBA处理后，Ct值显著增加，从而可以断定5ghmC位点的存在。 综上，实验结果表明硼酸介导的聚合酶链反应试剂盒，除了具有较强的底物专一性之外，还 不受酶切位点的限制，可以应用于任何序列5hmC的检测分析。
[0049] 本发明在小鼠胚胎干细胞基因组DNA高通量测序（Illumina ChIP-Seq， GSE43262)结果中挑选B细胞转录因子相关基因 PAX5的三个PCR扩增区域（INTR0N_ PAX5_1, INTR0N_PAX5_2, INTR0N_PAX5_3)，同时选取UTR-5_SRR作为定量PCR 的内部参考基 因，针对不同的基因序列设计特异性引物，然后分别采用硼酸介导的聚合酶链反应和MspI 酶解法考察选取区域5hmC含量情况。附图6c显示，选取的PAX5序列不含有CCGG特异性 序列，在MspI酶解后，ACt没有发生明显变化（ACt < 0. 7);但是，扩增模板经过2-CB-PBA 处理后，选取的PAX5三个区域的Ct值发生显著变化（ACt=L 5-7. 5)，表明了 5ghmC位点的 存在(与化学标记-高通量测序的结果是相一致的，见附图6b)，再次证明了 MspI酶解法在 检测基因水平5hmC的局限性。
[0050] 通过以上的实例证明了本发明利用加入的硼酸或其衍生物试剂与葡萄糖邻位二 醇之间的反应，来抑制DNA聚合酶的扩增活性，从而实现对不同基因序列中5hmC的特异性 分析，该方法和相关试剂盒具有不受序列位点限制、准确、快速、灵敏度高等优点，具有广阔 的应用前景。
【主权项】
1. 一种聚合酶链反应方法和一种试剂盒，可准确检测DNA中5-羟甲基胞嘧啶，其特征 在于： 1. DNA片段中的5-羟甲基胞嘧啶可被葡萄糖基化； 2) 非5-羟甲基胞嘧啶的DNA碱基不能被葡萄糖基化； 3) 硼酸类化合物可与葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶中的顺式邻二醇发生共价作用，并 通过这种作用显著抑制含葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶DNA片段的复制与扩增； 4. DNA的复制与扩增是通过聚合酶链反应； 5) 如果DNA不含5-羟甲基胞嘧啶，其复制与扩增则不受硼酸类化合物的影响； 6) 含5-羟甲基胞嘧啶DNA与不含5-羟甲基胞嘧啶DNA的检测分析。2. 基于权利要求1所述的方法与试剂盒，其检测依次包括以下步骤： 1) 利用葡萄糖基化反应，将基因组DNA中5-羟甲基胞嘧啶转化成葡萄糖基化5-羟甲 基胞嘧啶，从而与5-甲基胞嘧啶以及胞嘧啶相区分； 2) 利用硼酸或其衍生物试剂和葡萄糖基邻位二醇之间的反应，引入阻碍DNA复制的基 团，从而来抑制特定基因序列片段正常的聚合酶链反应，使反应产率降低；另外，在葡萄糖 基化反应基础上，不添加硼酸或其衍生物试剂，则特定基因/片段是正常的聚合酶链反应， 从而在基因水平实现了对5-羟甲基胞嘧啶的选择性识别；此过程可采用实时荧光定量聚 合酶链反应检测硼酸或其衍生物试剂对DNA复制过程的影响。3. 基于权利要求1所述的方法与试剂盒，其特征在于，所述的聚合酶链反应方法与试 剂盒需要硼酸或其衍生物试剂：硼酸、苯硼酸、3-氯苯基硼酸、2-(2'_氯苄氧基)苯基硼酸、 3-(单磺酰胺）苯硼酸或其他可与邻二醇作用的硼酸类衍生物试剂。4. 基于权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒使用聚合酶链反应程序 是：起始95°C预变性2分钟；循环程序：95°C变性15秒，57°C退火15秒，25°C延伸60秒，共 40个循环。5. 基于权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括阳性对照探针和阴 性对照探针。6. 基于权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，待测样品包括： 1) 各种生物DNA; 2) 同一种生物不同的组织或不同细胞DNA; 3) 各种生物的线粒体DNA。7. -种聚合酶链反应试剂盒的用途，其特征在于，所述的试剂盒可应用于各种生物、细 胞、组织、各种序列中5-羟甲基胞嘧啶的检测分析；应用于阐明5-羟甲基胞嘧啶在基因组 重新编程、基因表达的转录调控、DNA去甲基化、肿瘤形成以及诸多未知领域的生物学功能 研究；应用于各种疾病诊断。
【专利摘要】本发明一种硼酸介导的聚合酶链反应检测DNA中5-羟甲基胞嘧啶的方法和试剂盒。本发明结合葡萄糖基化反应，利用硼酸及其衍生物试剂可与葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶中的邻二醇发生的共价作用，显著增加被复制碱基单元的体积，有效抑制聚合酶扩增反应的特点，提出硼酸介导的DNA聚合酶链扩增反应，可特异性地识别特定基因/片段中的5-羟甲基胞嘧啶。在此基础上，发展了一种快速、灵敏测定5-羟甲基胞嘧啶的试剂盒，可应用于各种细胞分析；与传统的检测试剂盒相比，该方法不受酶切位点限制，可适用于各种序列中5-羟甲基胞嘧啶的分析鉴定。本试剂盒具有广阔的应用前景，对于进一步阐明5-羟甲基胞嘧啶的生物学功能具有十分重要的意义。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104928351
【申请号】CN201410102734
【发明人】汪海林, 赵超, 赵柏林, 李翠平
【申请人】中国科学院生态环境研究中心
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2014年3月19日