响
[0060] 氮源试验时以蔗糖为固定碳源；待测氮源为干酪素、硝酸钠、硫酸铵、牛肉膏、蛋白 胨，25°C、150r/min摇床培养48h后测定蛋白酶活。如图2所示，蛋白胨作为氮源的时候， WFWBac-I菌株的酶活最高，而牛肉膏、干酪素相对较低，而碳酸钠、胺对产酶可能有一定的 抑制作用，令酶的活性极低。所以，蛋白胨作为氮源是最佳的选择。
[0061] 3、发酵时间对WFWBac-I细菌产酶影响
[0062] 将活化好的菌悬液接入装有150mL、pH自然的培养基的摇瓶（250mL)中，25°C、 150rpm发酵3d，间隔12h取一次样，研宄不同发酵时间对WFWBac-I菌株产蛋白酶的影响。 如图3所示，发酵时间对菌种产酶量的大小有较显著的影响，随着发酵时间的变化，产酶量 呈现先增后减的趋势。这可能是因为发酵时间的延长，培养基中菌株消耗的营养物质增多， 剩下的营养物质减少，而且有毒代谢物质的增多，发酵液PH也随之发生变化，从而抑制菌 株的正常生长代谢活动，导致菌体的衰亡，进而引起酶的量减少。发酵时间为48h时，产酶 量达到最高水平。所以最终选择发酵时间为48h。
[0063] 4、培养温度对WFWBac-I菌株产酶影响
[0064] 在对发酵培养基进行优化的基础上，将WFWBac-I菌株的发酵温度分别设置为 5°C，15°C，25°C，35°C，研宄不同培养温度对发酵产蛋白酶的影响，在pH自然、150rpm的条 件下发酵3d，发酵结束后测发酵上清液的粗酶活性。如图4所示，温度对菌的产酶量有明显 的影响，其中温度为25°C和37°C时产酶量较高。在25°C时，酶活最高，且该温度在实验条 件下较容易达到和控制，这有利于今后该菌株的蛋白酶开发利用，最终选择的发酵温度为 25。。。
[0065] 5、培养基起始pH值对WFWBac-I菌株产酶影响
[0066] 在对发酵培养基进行优化的基础上，将培养基pH值分别调至1. 5, 2. 5, 3. 5,4. 5， 5. 5,6. 5, 7. 5,8. 5,9. 5,10. 5和11. 5,在25°C、150rpm的条件下发酵3d，发酵结束后测发酵 上清液的粗酶活性。试验不同pH值对WFWBac-I菌株产蛋白酶的影响。如图5所示，培养 基的pH对菌种产酶量的影响明显，初始pH值对菌株的生长和代谢有直接影响，初始pH值 应使菌株快速生长并且有利于代谢产物的产生在pH为9. 0时产酶量最高。所以最终选择 在pH9. 0时为最佳培养pH。
[0067] 6、接种量对WFWBac-I菌株产酶影响
[0068] 将种子液分辨按照2 %，5 %，10 %，15 %，20 %的接种量接入基础发酵培养基，其余 条件相同，3d后测定酶活，每个样品测定三个平行结果取平均值。接种量会影响菌株发酵过 程中菌株的生长速率和生长代谢产物的产量大小。由图6可见，接种量从2. 5%到10%，随 着接种量的增大，当接种量达到10%时，酶活达到最大。当接种量继续增大时，酶活的大小 出现下降的趋势。原因可能是接种量过大，引入的有害物质相应增多，对产物的合成不利， 或者在发酵的前期生长由于过于旺盛，空间和资源相对匮乏，培养基中的营养成分被大量 消耗，进而影响发酵后期代谢产物的形成和分泌。所以，最终确定WFWBac-I菌株液体发酵 的最佳接种量为10%。
[0069] 实施例3菌株粗酶液性质的研宄
[0070] 1、酶的最适反应温度的确定
[0071] 将筛选得到的菌株WFWBac-I发酵产生的粗酶液分别放于0, 20,40,和80°C的条件 下，保温lh，取出粗酶液，加入底物偶氮酪蛋白放于37°C下，利用Folin-酚法进行酶活性的 测定，确定酶的最适反应温度。如图7所示，粗酶液中蛋白酶的最适温度为20°C，此时酶活 为1078U/mL，这是多种蛋白酶综合作用的结果，说明该菌产生的蛋白酶属于低温蛋白酶。
[0072] 2、酶的最适作用pH值的确定
[0073] 将筛选得到的菌株WFWBac-I发酵产生的粗酶液分别与pHl，3, 5, 7,9,11和13的 Britton-Robsion缓冲液以1:1的比例混合，在4°C放置lh，分别在相应的pHl，3, 5, 7,9,11 和13条件下，用Folin-酚法测定混合液的酶活性，以未与缓冲液混合的作为对照。结果可 知，WFWBac-I菌株产生的蛋白酶在pH9. 0时具有最高活性，说明WFWBac-I菌株产生的蛋白 酶是碱性蛋白酶，在碱性较高条件下，仍具有较高的酶活，酶活大小为1027U/mL。
[0074] 3、蛋白酶抑制剂及金属离子对粗酶的影响
[0075] 将筛选得到的菌株WFWBac-I发酵产生的粗酶液分别与蛋白酶抑制剂EDTA(金属 蛋白酶抑制剂，5mM)，PMSF (丝氨酸蛋白酶抑制剂，2. 5mM)及浓度为5mM的金属离子Ba2+， Mn2+，Zn2+，Cu2+，Na+以1:1的比例混合，在4°C放置30min后，用Folin-酚法进行酶活性的 测定，以未处理的粗酶液为对照，计算其剩余酶活。
[0076] 表2蛋白酶抑制剂及金属离子对粗酶的影响
[0077]
[0078] 由表2可知，Zn2+对该粗酶有抑制力，剩余酶活力为87. 48%，其次是Cu 2+(剩余 酶活力为98. 63% )。而5mM的Mn2+可以明显增强酶活力。可知，该酶为一种Mn 2+激活酶。 EDTA的抑制率为15%左右，PMSF的抑制率为20%左右。在已报道的酶中，约有三分之一 的酶是金属酶或金属激活酶，需要有金属离子的存在，酶才能充分表现活性。
[0079] 实施例4菌株粗酶液性质的研宄
[0080] 该蛋白酶酶解豆柏及干酪素的水解度如表3所示，该蛋白酶酶解干酪素的水解度 为70. 83%，而酶解豆柏的水解度高达92. 90%。说明该蛋白酶几乎可酶解豆柏中的大部分 蛋白质。该蛋白酶酶活的最适pH为9,最适温度为40°C，即为碱性中温蛋白酶，而且耐受较 宽的碱性环境，因此可作为洗衣液，洗洁精的主要材料。
[0081] 表3豆柏及干酪素的水解度
【主权项】
1. 一种菌株，其特征在于，所述的菌株的保藏编号为CGMCC NO. 10703。2. 权利要求1所述的菌株在发酵生产碱性蛋白酶中的应用。3. -种代谢生产碱性蛋白酶的方法，其特征在于，所述的方法是以权利要求1所述的 菌株接种到培养基中进行发酵培养来生产碱性蛋白酶。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培养基以蔗糖为碳源，蛋白胨为氮 源，初始pH为9.0。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养，其温度25 °C，振荡培养 48h〇6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的权利要求1所述的菌株的接种量为 10%〇7. 权利要求3所述的方法生产的碱性蛋白酶，其特征在于，所述的碱性蛋白酶的最适 作用温度为20°C，最适作用pH为9. 0, Mn2+对该酶有较强的激活作用，Zn 2+，EDTA和PMSF对 该酶具有一定的抑制作用。8. 权利要求7所述的碱性蛋白酶在制备洗衣液或洗洁精中的应用。
【专利摘要】本发明目的是提供一种产低温碱性蛋白酶的菌株，为芽孢杆菌(Bacillus sp.)WFWBac-1，于2015年4月9日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10703。本发明筛选的菌株用于发酵生产碱性蛋白酶。本发明筛选的菌株性状优良、产蛋白酶活力高；该菌株在以蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源，培养基初始pH9.0，培养温度25℃，接种量为10％的条件下150rpm振荡培养48h时，所产蛋白酶活性最高能达到995U/mL。所制备的酶用于制备洗衣液或洗洁精。CGMCC NO.1070320150409
【IPC分类】C12R1/07, C12N9/54, C11D3/386, C12N1/20
【公开号】CN104946573
【申请号】CN201510416949
【发明人】王凤舞
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月16日