，其中样品中的 HbAlc与抗HbAlc抗体反应生成可溶性抗原-抗体复合物。添加聚半抗原与过量的抗HbAlc 抗体反应形成不溶性抗体-聚半抗原复合物，其可通过比浊法来测量。溶血的样品中释放 的血红蛋白被转化成为具有特征性吸收谱的衍生物，其可在预孵育期间通过双色法测量。 最终的结果表示为总血红蛋白的HbAlc百分比（Cobas?, Application note A1C-2)。
[0640] 3曰固醇水平测宙
[0641] 该测定是酶比色法。在镁离子存在下，硫酸葡聚糖选择性地与LDL、VLDLA和乳糜 微粒形成水溶性复合物，其耐受PEG修饰的酶。通过以PEG与氨基偶联的胆固醇酯酶和胆固 醇氧化酶酶法测定HDL胆固醇。胆固醇酯定量分解成游离胆固醇和脂肪酸。HDL胆固醇被 酶促氧化为胆甾-4-稀-3-酮和H2O2，以比色法测量所形成的H20 2 (c〇bas?; Application note HDLC3)〇
[0642] 通过非离子去污剂和糖化合物与脂蛋白（VLDL和乳糜微粒）的相互作用，利用LDL 选择性胶束增溶来直接测定LDL。糖化合物与去污剂的组合可以选择性测定血浆中的LDL。 测试原理与胆固醇和HDL的测试原理相同，但由于糖和去污剂，仅LDL胆固醇酯分解成游 离胆固醇和脂肪酸。随后氧化游离胆固醇，以比色法测量所形成的H2O2(Application note ldl_c，Cobas⑨）。
[0643] 高脂饲喂的C57BL/6J小鼠的体重增加
[0644] 使6周龄的C57BL/6J雄性小鼠适应自由获取高脂饮食（HFD) (D12492, Research Diet Inc.，New Brunswick，USA)和水的新环境4周。开始肽处理之前，以100 μ 1载剂 s.c.注射动物三天，使动物适应抓取和注射。每天两次用毒蜥外泌肽_4、化合物3、化合物 6、化合物7、化合物8、化合物11和化合物12或者载剂处理小鼠。整个研宄中，每天记录体 重，并将其用于施用以体重校正剂量的肽。同一天，通过颈椎脱位处死所有动物。
[0645] 高脂饲喂的C57BL/6J小鼠给药后2、4、6、8、10和12小时的口服葡萄糖耐量
[0646] 使6周龄的雄性C57B1/6J小鼠适应自由获取高脂饮食（D12492, Research Diet Inc.，New Brunswick，USA)和水的新环境。以100 μ 1载剂s. c.注射动物三天，使动物适 应抓取和注射。从尾尖取血液样品并测量血液葡萄糖。按照制造商的说明，通过固定葡萄 糖氧化酶法使用一滴血液（< 5 μ I ;Contour Autoanalyser，Bayer，Denmark)分析血液葡 萄糖（mM)浓度。4周之后，称重高脂饮食的动物，将体重用于施用以体重校正剂量的肽。使 动物禁食4小鼠之后，进行口服葡萄糖耐量测试（0GTT)。单次给予肽或载剂之后2、4、6、8、 10和12小时，取初始血液样品（t = -0分钟）。紧接着，给予口服剂量的葡萄糖（lg/kg)， 并将动物放回其原笼中（t = 0)。在t = 15分钟、t = 30分钟、t = 60分钟和t = 90分 钟时测量BG水平。取血之后立即通过(：02麻醉继而颈椎脱位来处死所有动物。
[0647] 年轻清瘦和年老肥胖的C57BL/6J小鼠的食物摄取
[0648] 高脂饮食饲喂C57BL/6J小鼠11天，并且高脂饮食饲喂C57BL/6J小鼠52周。
[0649] 研宄前第3天，将小鼠转移至单个笼并称重。研宄前第4天，通过每天s.c.注射 使其适应抓取和处理。实验的前一天，在20:00除去食物。实验当天，称量小鼠，并在t = 0小时（8 :00)和t = 12小时（20 :00) s. c.注射毒蜥外泌肽-4、化合物7或载剂处理小鼠。 处理（t = 0)之后立即将预先称重的食物引入给小鼠，并在t= 1、2、4、8、12和24小时通 过称量剩余食物来测量累积食物摄取。在t = 24小时称量食物和动物之后，通过颈椎脱位 处死小鼠。
[0650] 肝细胞cAMP形成
[0651] 实验过程
[0652] 在TB缓冲液中小心清洗Lonza Walkersvill，Inc.提供的原代人肝细胞，并在 37°C下用补加了 100 μΜ IBMX和0. 1%酪蛋白的溶于TB缓冲液的肽孵育15分钟。添加至细 胞之前，将肽稀释液预热至37 °C。通过添加25 μ 1冰冷的0. 5M HCl来终止反应，在冰上孵 育细胞60分钟。通过在以闪烁剂和抗cAMP抗体包被的96孔微滴定"闪板（FlashPlate) " 中，将来自孔的25 μ 1酸提取物添加至pH 6. 2的75 μ 1乙酸钠缓冲液来测定孔中cAMP的 含量。向每孔中添加100 μ 110 μ Ci [125I] cAMP溶液之后，在4°C过夜孵育该板，排空，并使用 TopCount NXT中的程序" [125I]cAMP闪板10分钟"来计数结合至闪板上的[125I]cAMP的量。
[0653] 在0· 1~1000 nM的浓度范围测试肽。
[0654] 数据分析和统计
[0655] 通过对cAMP标准曲线的外推来计算细胞所产生的cAMP的量。
[0656] 使用Sigma Plot通过将cAMP数据拟合入下式来估计EC5tl值：
[0657]
[0658] 以下实施例进一步说明本发明。
[0659] C57BL/6J小鼠的肝重/体重
[0660] 每天两次用化合物1和化合物11 (以两个剂量：0. 5和5nmol/kg)或载剂皮下处 理小鼠2周。在整个研宄中，每天记录体重，并将其用于施用以体重校正剂量的肽。处死的 当天，暴露肝并称重。
[0661] 实施例
[0662] 实施例1 :化合物的合成和肽的特性
[0663] 合成实施例：
[0664] 按上文所述，使用 TentaGel S Ram树脂（I. 17g ;0· 23mmol/g)和 Fmoc 化学，用 CEM Liberty肽合成仪合成化合物9。在17位使用Fmoc-Lys (ivDde)-OH，并在肽骨架中使用假 腫氨酸（pseudoproline)Fmoc-Phe-Thr(· Psi. Me，Me pro)-〇H 和 Fmoc-Asp(OtBu)-SerC Psi.，Me，Me pro)-OH。在树脂中完成肽骨架之后，人工切除N端Fmoc基团，随后使用DCM 中的Boc20(226mg)和DIEA(54yl)进行Boc保护。随后用新鲜配制的水合肼/NMP(4% ; 2 X 15分钟）切除ivDde基团。返回CEM Liberty肽合成仪，将剩余的两个构建部分 Fmoc-Glu-OtBu和十六烧酸添加至未保护的赖氨酸侧链。
[0665] 按上文所述，从树脂上切除肽，以35ml/分钟的缓冲液A (0. 1 % TFA，aq.)和缓冲 液 B (0· 1 % TFA，90% MeCN，aq.)之混合物的流速，用 Gemini-NX 柱（5cm，10 μ m，C18)进行 纯化。经47分钟用从25%至65%线性梯度的缓冲液B洗脱产品，通过级分收集器收集级 分（9ml)。通过分析型HPLC和MS分析相关的级分，合并纯度超过95%的级分，并将其冷冻 干燥成白色粉末。通过分析型HPLC测得72mg的产品具有97%的纯度，以MS测得质量为 3697. OOTa (计算值 3696. 97Da)。
[0666] 实施例2 :对GLP-I和胰高血糖素受体的效力
[0667] 通过将表达hGlucagonR和hGLP-lR的细胞暴露于浓度递增的所示酰化化合物来 估计GluGLP-I激动剂的效力，并按照方法部分的描述测量所形成的cAMP。
[0668] 结果见表1 :
[0669] 表1.酰化化合物对GLP-I受体和胰高血糖素受体的EC5tl值
[0670]
[0671] 标记（）的残基形成分子内内酰胺环。
[0672] 表1a本发明的其他酰化化合物的EC5tl值
[0673]
[0674]
[0676] 化合物 28H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K (十六烷酰基-E) -AAHDFVEWLLSA-NH2 还可 写成 H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K (十六烷酰基-a Glu) -AAHDFVEWLLSA-NH2。
[0677] 实施例3 :药代动力学筛选：
[0678] 测定多种酰化化合物的药代动力学特性。表2中显示与（非酰化的）化合物1相 比的所计算的Τ1/2值。
[0679] 表 2
[0680]
[0681] * :仅使用两个时间点来计算Tl/2。
[0682] 与化合物1相比所有酰化化合物具有改善的T1/2。
[0683] 化合物13的样品药代动力学特性显示于图1中。
[0684] 实施例4 :DI0小鼠中的口服葡萄糖耐量测试
[0685] 在长期高脂饲喂的C57BL/6J小鼠中s. c.施用化合物Il(IOnmoVkg) 21天对口服 葡萄糖耐量的作用。使高脂饲喂的小鼠禁食，取初始血液样品来测定禁食血液葡萄糖水平 (t = 0)。随后给予口服剂量的葡萄糖（lg/kg，于5ml/kg中），在t = 30分钟、t = 60分 钟、t = 90分钟和t = 120分钟测量血液葡萄糖水平。化合物11显著改善葡萄糖耐受（两 因素 AN0VA)。数据表示为平均值土标准误。
[0686] 实施例5 :28天之后db/db小鼠中的HbAlc
[0687] 以载剂或化合物7处理糖尿病（db/db)小鼠4周，测定收集自经处理小鼠的全血 样品（20 μ 1)中 HbAlc ( C〇baS? application note :A1C_2)。结果见表 3。通过从每只小 鼠第4周时的HbAlc (%)中减去其在处理开始时的HbAlc (%)来计算Λ HbAlc (% )。用 化合物7处理显著降低AHbAlc(% )。（Ρ = 0· 03 ;Students t检验），与载剂相比。
[0688] 实施例6 :降低的体重
[0689] 测定在长期高脂饲喂的C57BL/6J小鼠中s. c.施用化合物11 21天对体重的 作用。以化合物Il(IOnmoVkg)或载剂处理（一天两次；s. c.)高脂饮食（HFD)的雄性 C57BL/6J小鼠。在整个研宄中，每天记录体重并将其用于施用以体重校正剂量的肽。在图 4中，数据显示为平均值土标准误。化合物11显著降低体重（p < 0. 05)。
[0690] 实施例7 :总胆固醇和HDL/LDL比值
[0691] 用载剂或化合物7处理饮食诱导肥胖（DIO)小鼠4周，从收集的血液样品中制备 血衆。测定每个血衆样品中总胆固醇、LDL和HDL( C〇baS? application note :CH0L2、 HDLC3和LDL_C)，结果见图5和6。以化合物7处理显著（P < (λ 0001，Students t检验） 降低总胆固醇浓度（图5)并且显著（P <0· 0001，Students t检验）增加 HDL/LDL比值 (图 6)。
[0692] 实施例8 :高脂饲喂的C57BL/6J小鼠中的体重增加。
[0693] 在短期高脂饲喂的C57BL/6J小鼠中s. c.施用毒蜥外泌肽-4、化合物8、化合物 3、化合物7、化合物11、化合物12和化合物610天的作用。处理（一天两次；s. c.) (0. 5和 5nmol/kg)(或用载剂）高脂饮食（HFD)的C57BL/6J雄性小鼠。在整个研宄中，每天记录体 重并将其用于施用以体重校正剂量的肽。在图7中，数据显示为平均值土标准误。
[0694] 在这两个剂量（0. 5和5nmol/kg)下，对照肽（毒蜥外泌肽-4)以及化合物8显著 降低体重增加。在高剂量（5nmol/kg)而非低剂量（0. 5nmol/kg)下，化合物3、化合物7、化 合物11和化合物12显著降低体重增加（图7)。化合物6仅在低剂量（0. 5nmol/kg)下显 著降低体重增加。
[0695] 实施例9 :在高脂饲喂C57BL/6J中，给药后2、4、6、8、10和12小时的口服葡萄糖 耐量
[0696] 使动物禁食4小时之后进行口服葡萄糖耐量测试（OGTT)。化合物7或载剂给药之 后2、4、6、8、10和12小时，取初始血液样品（t = -0分钟）。紧接着，给予口服剂量的葡萄 糖（lg/kg)。在t = 15分钟、t = 30分钟、t = 60分钟和t = 90分钟测量BG水平。取血 样之后，立即通过〇)2麻醉然后颈椎脱位来处死所有动物。
[0697] 该研宄显示在高脂饲喂的C57BL/6J小鼠中，给药后2、4、6、8、10和12小时皮下施 用化合物7(10nmol/kg)显著改善葡萄糖耐受（以口服葡萄糖耐受测试过程中降低的AUC 来测量）。
[0698] 实施例10 :年轻清瘦的和年老肥胖的C57BL/6J小鼠中的食物摄取
[0699] 高脂饮食饲喂C57BL/6J小鼠11天，并且高脂饮食饲喂C57BL/6J小鼠52周。
[0700] 实验当天，称量小鼠，并在t = 0小时（8 :00)和t = 12小时（20 :00)通过s. c.注 射毒蜥外泌肽-4、化合物7或载剂处理小鼠。处理之后立即（t = 0)将预先称重的食物引 入给小鼠，并在之后t = 1、2、4、8、12和24小时通过称量剩余食物来测量累积食物摄取。
[0701] 在年轻清瘦小鼠中，在0~4、0~8、0~12和0~24时间段，化合物7统计学显 著性地（P < 0. 05)减少食物摄取。在0~2、0~4、0~8、0~12和0~24时间段，毒蜥 外泌肽-4统计学显著性地（p < 0. 05)减少食物摄取。
[0702] 在0~2、0~4、0~8、0~12和0~24时间段，在年老肥胖症小鼠中，化合物7 统计学显著性地（P < 0. 05)减少食物摄取。在全部时间段中，毒蜥外泌肽-4统计学显著 性地（P < 0. 05)减少食物摄取。
[0703] 实施例11 :在高脂饮食饲喂30周的小鼠中皮下施用GluGLP-I激动剂化合物11 3 周对脂质的作用。
[0704] 每天两次以载剂（PBS)、10nmol/kg毒蜥外泌肽-4或10nmol/kg化合物11处理在 处理（s.c)之前经30周高脂饮食的小鼠3周对脂质的作用（图11)。测量对LDUHDL和甘 油三酯的作用（CH0 :总胆固醇；HDL :高密度胆固醇；LDL :低密度胆固醇；TRIG :甘油三酯； HDL/LDL :HDL 与 LDL 的比值）。
[0705] 化合物11显著降低胆固醇、HDULDL (P < 0. 001)和甘油三酯（P < 0. 05)，而HDL/ LDL的比值显著增加 （p < 0. 001)(图11)。HDL/LDL的比值被认为是心脏病的风险指标。 该比值越高，心脏病发作或其他心血管问题的风险越低。
[0706] 实施例12 :化合物11对肝细胞cAMP形成的作用。
[0707] 除了纯GLP-I激动剂毒蜥外泌肽-4和利拉鲁肽（Iiraglutide)外，所有受试肽对 于GluR刺激的cAMP形成发挥完全激动剂的作用。从表格中可以观察到效力的排名顺序是： 化合物1 >胰高血糖素>化合物11 >胃泌酸调节素>>>毒蜥外泌肽-4和利拉鲁肽（表 9) 〇
[0708] 最后，在高浓度下，未观察到Emx cAMP应答的下调，这与在hGluR HEK293细胞中 所观察到的结果相反。
[0709] 表9.人原代培养物中胰高血糖素对cAMP形成的激动作用
[0710]
[0711] 实施例13 :处理2周的C57健康对照小鼠的肝重
[0712] 与非酰化的双效GluGLP-I激动剂化合物1相比，以长效酰化双效GluGLP-I激动 剂（例如，化合物11)重复处理不产生肝大小的改变（增大或缩小）（图12)。
[0713] 实施例14 :db/db小鼠28天之后的HbAlc
[0714] 以载剂或化合物11处理糖尿病（db/db)小鼠4周，测定收集自经处理小鼠的全血 样品（20 μ 1)中的 HbAlc (C〇baS? application note :A1C_2)。结果见图 13。通过从第 4周时每只小鼠的HbAlc(% )中减去其在处理开始时的HbAlc(% )来计算AHbAlc(% )。 以化合物11的处理显著降低AHbAlc(% )。（P = 0· 03 ;Students t检验），与载剂相比。
【主权项】
1. 化合物，其具有式： R1-Z-R2 其中R1是H、C H烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基； R2是 OH 或 NH2; 以及Z是具有式I的肽 His-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-X12-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-Ala-Al a-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-Ala-X30 ； (I) 其中 X2选自Aib和Ser ; X12 选自 Lys、Arg 或 Leu ; X16选自Arg和X ; X17选自Arg和X ; X20 选自 Arg、His 和 X ; X21 选自 Asp 和 Glu ; X24选自Ala和X ; X27选自Leu和X ; X28选自Arg和X ; X30是X或不存在； 其中父16、父17、父20、父24、父27、父28和父30中的至少一个是父； 以及其中每个残基X独立地选自：Glu、Lys、Ser、Cys、Dbu、Dpr和Orn ; 其中至少一个残基X的侧链与具有下式的亲脂取代基缀合： (i) Z1，其中Z1是直接与所述X的侧链缀合的亲脂部分；或者 (ii) Z1Z2,其中Z1是亲脂部分，Z 2是间隔物，以及Z 1通过Z 2与所述X的侧链缀合； 前提是 Z 不是 HSQGTFTSDYSKYLDS-K (十六烷酰基-y -Glu) -AAHDFVEWLLRA。2. 权利要求1的化合物，其中一个或更多个所述残基X独立地选自Lys、Glu和Cys。3. 权利要求1或权利要求2的化合物，其中： X16 选自 Glu、Lys 和 Ser ; X17 选自 Lys 和 Cys ; X20 选自 Hi s、Lys、Arg 和 Cys ; X24 选自 Lys、Glu 和 Ala ; X27选自Leu和Lys ;和/或 X28 选自 Ser、Arg 和 Lys。4. 权利要求1至3中任一项的化合物，其中所述式I的肽包含一种或更多种以下残基 组合： X2是Aib以及X17是Lys ; X2是Aib以及X17是Cys ; X2是Aib以及X20是Cys ; X2是Aib以及X28是Lys ; X12 是 Arg 以及 X17 是 Lys ; X12 是 Leu 以及 X17 是 Lys ; X12 是 Lys 以及 X20 是 Lys ; X12 是 Lys 以及 X17 是 Lys ; X16 是 Lys 以及 X17 是 Lys ; X16 是 Ser 以及 X17 是 Lys ; X17 是 Lys 以及 X20 是 Lys ; X17 是 Lys 以及 X21 是 Asp ; X17 是 Lys 以及 X24 是 Glu ; X17 是 Lys 以及 X27 是 Leu ; X17 是 Lys 以及 X27 是 Lys ; X17 是 Lys 以及 X28 是 Ser ; X17 是 Lys 以及 X28 是 Arg ; X20 是 Lys 以及 X27 是 Leu ; X21 是 Asp 以及 X27 是 Leu ; X2 是 Aib，X12 是 Lys 以及 X16 是 Ser ; X12 是 Lys，X17 是 Lys 以及 X16 是 Ser ; X12 是 Arg，X17 是 Lys 以及 X16 是 Glu ; X16 是 Glu，X17 是 Lys 以及 X20 是 Lys ; X16 是 Ser，X21 是 Asp 以及 X24 是 Glu ; X17 是 Lys，X24 是 Glu 以及 X28 是 Arg ; X17 是 Lys，X24 是 Glu 以及 X28 是 Lys ; X17 是 Lys，X27 是 Leu 以及 X28 是 Ser ; X17 是 Lys，X27 是 Leu 以及 X28 是 Arg ; X20 是 Lys，X24 是 Glu 以及 X27 是 Leu ; X20 是 Lys，X27 是 Leu 以及 X28 是 Ser ; X20 是 Lys，X27 是 Leu 以及 X28 是 Arg ; X16 是 Ser，X20 是 His，X24 是 Glu 以及 X27 是 Leu ; X17 是 Lys，X20 是 His，X24 是 Glu 以及 X28 是 Ser ; X17 是 Lys，X20 是 Lys，X24 是 Glu 以及 X27 是 Leu ;或 X17 是 Cys，X20 是 Lys，X24 是 Glu 以及 X27 是 Leu。5. 前述权利要求中任一项的化合物，其中所述式I的肽仅含有一个与所述亲脂取代基 缀合的类型的氨基酸。6. 权利要求5的化合物，其中所述肽含有仅一个Lys残基、仅一个Cys残基或仅一个 Glu残基，以及其中所述亲脂取代基与该残基缀合。7. 前述权利要求中任一项的化合物，其中所述式I的肽序列包含一个或更多个分子内 桥。8. 权利要求7的化合物，其中所述分子内桥在两个氨基酸残基的侧链之间形成，所述 两个氨基酸残基被式I的线性氨基酸序列中的3个氨基酸分隔开。9. 权利要求8的化合物，其中所述分子内桥在残基对16和20、17和21、20和24或者 24和28的侧链之间形成。10. 权利要求7至9中任一项的化合物，其中所述分子内桥是盐桥或内酰胺环。11. 权利要求7至10中任一项的化合物，其中所述分子内桥涉及残基对，其中： X16 是 Glu 以及 X20 是 Lys ; X16 是 Glu 以及 X20 是 Arg ; X16是Lys以及X20是Glu ;或 X16 是 Arg 以及 X20 是 Glu ; X17 是 Arg 以及 X21 是 Glu ; X17 是 Lys 以及 X21 是 Glu ; X17是Arg以及X21是Asp ;或 X17 是 Lys 以及 X21 是 Asp ; X20 是 Glu 以及 X24 是 Lys ; X20 是 Glu 以及 X24 是 Arg ; X20是Lys以及X24是Glu ;或 X20 是 Arg 以及 X24 是 Glu ; X24 是 Glu 以及 X28 是 Lys ; X24 是 Glu 以及 X28 是 Arg ; X24是Lys以及X28是Glu ;或 X24 是 Arg 以及 X28 是 Glu。12. 前述权利要求中任一项的化合物，其中X16、X17、X20和X28中的至少一个与亲脂 取代基缀合。13. 权利要求1至10中任一项的化合物，其中X30不存在。14. 权利要求1至10中任一项的化合物，其中X30存在而且与亲脂取代基缀合。15. 前述权利要求中任一项的化合物，其中所述化合物仅有一个亲脂取代基，其在16、 17、20、24、27、28或30位，优选在16、17或20位，尤其是在17位。16. 权利要求1至14中任一项的化合物，其中所述化合物精确地具有两个亲脂取代基， 每个取代基在16、17、20、24、27、28或30位中的一个位置。17. 权利要求16的化合物，其中所述化合物在以下位置具有亲脂取代基：16和17、16 和 20、16 和 24、16 和 27、16 和 28 或者 16 和 30 ; 17 和 20、17 和 24、17 和 27、17 和 28 或者 17 和 30 ;20 和 24、20 和 27、20 和 28 或者 20 和 30 ;24 和 27、24 和 28 或者 24 和 30 ;27 和 28或者27和30 ;或者28和30。18. 权利要求1的化合物，其具有式： R1-Z-R2 其中R1是H、C H烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基； R2是 OH 或 NH2; 以及Z是具有式IIa的肽 His-Aib-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-