一种假交替单胞菌重组氨肽酶的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和生物化学技术领域，涉及一种来自深海热液口的假交替 单胞菌 Pseudoalteromonas telluritireducens 16098 氨肽酶（aminopeptidase)的应用。
【背景技术】
[0002] 氨肽酶隶属于金属蛋白酶Ml家族，可水解蛋白质或多肽的N末端氨基酸，广泛 分布于动、植物和微生物中，在各种生物过程中起重要作用。氨肽酶多为锌离子依赖型金 属蛋白酶，根据氨肽酶催化水解多肽N末端氨基酸的偏好性，可分为丙氨酸氨肽酶、亮氨酸 氨肽酶、甲硫氨酸氨肽酶和脯氨酸氨肽酶等，亮氨酸氨肽酶为其中最有代表性的一类。在 人体中，白三稀A4水解酶（leukotriene A-4 hydrolase，LTA4H)为一类重要的亮氨酸氨 肽酶，它由Peptidase_Ml和1^1^-44-117(11'〇_(]两个结构域组成，与人体多种恶性肿瘤的发 生息息相关，可作为人类临床肝胆疾病的诊断指标。近年来，在大肠杆菌、嗜热脂肪芽孢杆 菌BaciIIus stearothermophiIus、水稻黄单胞杆菌Xanthomonas oryzae、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureu等微生物中陆续报道了多种不同类型的氨肽酶，但在海洋微生物中 氨肽酶功能相关研宄较少，仅有科尔韦氏菌Colwellia psychrerythraea中的亮氨酸氨肽 酶及高温球菌Thermococcus中的甲硫氨酸氨肽酶等。
[0003] 假交替单胞菌P. telluritireducens 16098分离自深海热液口附近，其在高压、 高盐、少光照、极温、高重金属等环境因素的自然选择下，必然会适应产生一系列结构新颖、 作用机制特殊并具有潜在应用前景的功能蛋白，因此开展功能蛋白的发掘及应用基础具有 十分重要的理论与实践意义。P. telluritireducens 16098氨肽酶基因编码区为1845bp， 编码蛋白的成熟肽含593个氨基酸残基，由Peptidase_Ml和Leuk-A4_hydro_C两个结构域 组成，与深海嗜冷微生物C. psychrerythraea中的低温亮氨酸氨肽酶相似度为71. 4%，与 人LTA4H相似度为48. 7%。本发明将对P. telluritireducens 16098氨肽酶进行体外原核 重组表达，对重组蛋白的酶学活性进行深入研宄，研宄结果对深海微生物新型蛋白酶的开 发具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种来自深海热液口的假交替单胞菌Pseudoalteromonas telluritireducens 16〇98 氨肽酶（aminopeptidase)的应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
[0006] 一种假交替单胞菌重组氨肽酶的应用，重组氨肽酶来自深海热液口的假交替单胞 菌Pseudoalteromonas telluritireducens 16098氨肽酶的重组蛋白，其作为蛋白水解酶 的应用。
[0007] 所述重组蛋白的获得：
[0008] (1)所述P. telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白是在其成熟肽编码区的两 端分别设计含有限制性酶切位点的引物（序列为5' -CATATGAACGCGATTGATCAAAACTCAT-3' 和 5' -CTCGAGTTATTTATCAAATAAAGCGTC-3' ）；
[0009] (2)而后通过PCR扩增获得编码区基因，并将其克隆到pET-30a(+)表达载体中，随 后转入宿主细胞大肠杆菌Transetta(DE3)中实现原核体外重组表达；
[0010] (3)P. telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白在非变性条件下利用镍琼脂糖 凝胶柱进行纯化。
[0011] 所述 P. telluritireducensl6098 氨肽酶的重组蛋白在 28°C、pH 7. 2 时，对 L-亮 氨酸7-氨基-4-甲基香豆素具有显著的氨肽酶活性，其Km值为44. 56 ±5. 09 μ mol L'
[0012] 所述P. telluritireducens 16098氨肽酶的重组蛋白的最适温度范围为 28°C -40°C，在50°C以上热稳定性较低。
[0013] 所述P. telluritireducens 16098氨肽酶的重组蛋白的最适pH范围为7. 2-8. 0， 且在pH 9. 0-12. 2时可检测到活性。
[0014] 所述P. telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白可耐受高盐浓度及部分金属 离子，但低盐浓度及Cu2+、Zn2+和Cd2+等金属离子可显著抑制重组蛋白活性，EDTA、蛋白酶抑 制剂等亦对重组蛋白的活性具有一定的抑制作用。
[0015] 本发明所具有的优点：
[0016] 本发明所获得的P. telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白在28 °C、 pH 7. 2时，对L-亮氨酸7-氨基-4-甲基香豆素具有显著的氨肽酶活性，其Km值为 44. 56±5. 09 μπιο? L-1。重组蛋白最适温度为28°C -40°C，在50°C以上热稳定性较低；最适 pH为7. 2-8. 0,且在pH 9. 0-12. 2时可检测到活性；重组蛋白可耐受高盐浓度及部分金属离 子，但低盐浓度及Cu2+、Zn2+和Cd2+等金属离子可显著抑制重组蛋白活性，EDTA、蛋白酶抑制 剂等亦对重组蛋白的活性具有一定的抑制作用。可见本发明获得的重组蛋白可用于将氨基 酸从蛋白或多肽的N末端解离，在蛋白降解方面具有潜在应用价值。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实施例提供的P. telluritireducens 16098氨肽酶成熟肽编码区体 外原核重组表达（A)和纯化（B)图。
[0018] 图2为本发明实施例提供的重组P. telluritireducensl6098氨肽酶的米氏方程 曲线图。
[0019] 图3为本发明实施例提供的温度对重组P. telluritireducensl6098氨肽酶活性 的影响图。
[0020] 图4为本发明实施例提供的重组P. telluritireducensl6098氨肽酶的热稳定性 图。
[0021] 图5为本发明实施例提供的pH对P. telluritireducens 16098氨肽酶活性的影 响图。
【具体实施方式】
[0022] 下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0023] 本发明是通过PCR技术克隆获得了 P. telluritireducens 16098氨肽酶成熟肽的 编码区序列，克隆到pET-30a(+)表达载体中，在大肠杆菌Transetta (DE3)中实现原核体外 重组表达。经镍琼脂糖凝胶纯化获得的重组蛋白分子。
[0024] 本发明利用体外重组表达技术获得了 P. telluritireducens 16098氨肽酶 重组蛋白，其在28°C、pH 7.2时，对底物L-亮氨酸7-氨基-4-甲基香豆素的Km值为 44.56±5.09以111〇1171;最适温度为28°〇-40°〇，最适口!1为7.2-8.0，在？!19.0-12.2时仍 可检测到活性；可耐受高盐浓度及部分金属离子，低盐浓度、Cu2+、Zn2+和Cd2+等金属离子以 及EDTA、蛋白酶抑制剂等对重组蛋白活性具有显著抑制作用。本发明获得的重组蛋白可用 于将氨基酸从多肽链的N-末端解离，在蛋白消化等方面具有潜在应用价值。
[0025] 实验例I :P. telluritireducens 16098氨肽酶成熟肽编码区体外原核重组表达 和纯化
[0026] 1、重组载体的构建
[0027] 本发明中采用的重组载体为Novagen公司的pET_30a(+)原核表达载体。通过PCR 技术，采用5'末端分别添加了 Nde I和Xho I限制性酶切位点的引物Pl (5' -CATATGAA CGCGATTGATCAAAACTCAT-3'）和 P2(5' -CTCGAGTTAITTATCAAATAAAGCGTC-3'）扩增来自深海 热液口的假交替单胞菌P. telluritireducens 16098氨肽酶成熟肽的编码区。反应条件 为：首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环：94°C变性30秒，65°C退火30秒，72°C延伸 2分钟，共进行35个循环，最后72°C延伸10分钟。用胶回收纯化试剂盒（大连宝生物工程 有限公司）将扩增片段纯化回收，与PMD19-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒， 并使用Nde I和Xho I对质粒进行双酶切；回收目的片段，并经Nde I和Xho I酶切的表达 载体pET-30a(+)连接，完成重组质粒的构建。
[0028] 2、重组蛋白的表达
[0029] 将构建好的重组质粒转化表达宿主菌大肠杆菌Transetta(DE3)中，并筛选阳性 克隆，测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于200mL的LB液体培养基中，220rpm， 37°C培养至OD 600 = 0. 4~0.8。加入IPTG(终浓度lmmol Γ1)，继续培养4小时后于 4°C 5000rpm离心10分钟，收集菌体，于-80°C冻存备用。取Iml菌液离心，弃去上清后，加 入80 μ 1水和20 μ 1的5X蛋白上样缓冲液，KKTC煮沸10分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表 达产物。
[0030] 3、重组蛋白的纯化
[0031] 本发明中重组蛋白在非变性条件下采用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化，即获得来自深 海热液口的假交替单胞菌Ρ. telluritireducens 16098氨肽酶重组蛋白。具体操作步骤如 下：
[0032] (1)镍琼脂糖凝胶FF装柱（I. 6 X 20cm)，柱床体积为IOml ;
[0033] (2)用缓冲液 I (50mmol T1Tris-HCLO. 5mol T1NaCLpH 7. 2)平衡 2-5个床体积， 流速为2ml mirT1;
[0034] (3)经IPTG诱导表达的细胞，用缓冲液I重悬，150瓦超声破碎30分钟，12000rpm， 4°C离心30分钟，上清液用0. 45 μ m滤膜过滤后，过柱，流速为Iml HiirT1;
[0035] (4)用缓冲液I再洗2-5个床体积，流速为2ml miiT1;
[0036] (5)用含有50mmol Γ1咪唑的缓冲液I再洗2-5个柱床体积，流速为2ml min
[0037] (6)依次用含有IOOmmol L'200mmol Γ1和400mmol厂1咪唑的缓冲液I洗脱目 的蛋白，流速为2ml mirT1;
[0038] (7)收集的蛋白在缓冲液 II (20mmol L-1Tris-HCl，400mmol T1NaCl, ρΗ7· 2)及去 离子水中透析，之后用SDS-PAGE检测获得的蛋白分子量和纯度。纯化蛋白冻干，存于-80°C 冰箱。
[0039] 实验结果：