~191位、第360~532位、第534~631位、第684~ 811位、第1038~1141位、第1143~1234位、第1236~1363位、或第1371~1462位的 核苷酸序列特异性结合；
[0033] 针对SEQ ID NO: 1所示猪附红细胞体al基因序列设计的引物对，该引物对用于 扩增所述猪附红细胞体al基因序列第45~191位、第360~532位、第534~631位、第 684~811位、第1038~1141位、第1143~1234位、第1236~1363位、或第1371~1462 位的核苷酸序列。
[0034] 实施例1猪源附红细胞体al基因的扩增和序列分析比对
[0035] L猪附红细胞体感染阳性血液
[0036] 从上海长宁、嘉定、松江区某屠宰场分别采集猪新鲜血液，提前于采样管中加入 抗凝剂柠檬酸三钠(浓度为1. 32%)，血液与抗凝剂比例为1:10。血液带回实验室，经基于gl 基因的TaqMan Real-time PCR技术检测为猪源附红细胞体阳性者用于试验。
[0037] 2.猪血基因组DNA的提取
[0038] 2. 1血液处理
[0039] 将41份经基于gl基因的TaqMan real-time PCR技术检测为猪附红细胞体阳性 的抗凝血以3000r/min离心10min,倒掉上层的溶液后，小心吸取中间红细胞(约500 μ L), 放入灭菌后的2mL离心管中，立即进行血液基因组DNA的提取，或放于-20°C保存备用。
[0040] 2. 2提血液基因组DNA的提取
[0041] 按照上海赛百盛基因技术有限公司生产的全血基因组DNA提取试剂盒说明书，提 取血液基因组DNA。
[0042] 3.猪附红细胞体al基因的扩增和序列分析比对
[0043] 3. 1猪附红细胞体al基因引物的设计
[0044] 根据GenBank中登录的猪附红细胞体德国54/96分离株al基因序列（登录号 AM265536)，应用Primer Premier5. O软件设计一对引物，上游引物：5'-CMCTAACTCCTGTGTA GCTGTAAT-3'（SEQ ID NO :2)，位于al基因核苷酸序列的第44-68位；下游引物：5'-TCTTT TAGTTGATTCATCTTAGCCT-3'（SEQ ID N0:3)，位于该基因核苷酸序列的第 1676-1700 位。引 物由上海英骏生物技术有限公司合成，预计扩增片段长度为1657bp。
[0045] 3. 2猪附红细胞体al基因的PCR扩增
[0046] 以经检测为猪附红细胞感染阳性的猪血液基因组DNA为模板进行扩增，PCR反 应体系为：l〇XPCR buffer2. 5μ L，上、下游引物（lOOymol/L)各 0· 2μ L，2. 5mmol/L dNTP4 μ L，模板 DNAL 0 μ L，Ex Taq 酶（5U/ μ L) 0· 25 μ L，加灭菌 ddH20 至 25 μ L。PCR 扩增 条件为：95°C预变性5min ;94°C变性45s，55°C退火60s，72°C延伸9〇8,37个循环；721：延伸 8min。PCR反应结束后，取5μ L PCR扩增产物，加1 μ L6 Xloading buffer，混合均匀后上 样，150V恒压电泳20min。电泳结束后取出凝胶，于成像系统Image Quant300 (美国GE公 司）中观察结果。
[0047] 结果如图1所示，对阳性猪附红细胞体全血基因组DNA进行al基因的PCR扩增， 获得了大小约为1660bp的扩增条带，与预期结果相符。图1中，M :DNA分子量标准DL2000 ; 1~7 :猪附红细胞体al基因 PCR扩增产物；P :阳性对照；N :阴性对照。
[0048] 3. 3PCR产物的纯化回收
[0049] 利用Axygen DNA胶回收试剂盒，对PCR产物进行纯化回收，具体操作步骤按试剂 盒说明书进行。
[0050] 3.4目的基因的克隆
[0051] 将胶回收产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转入Transl-TlPhage Resistant 化学感受态细胞中。
[0052] 3. 5重组质粒pMD18-T_al的鉴定和序列测定
[0053] 3. 5. 1重组质粒pMD18-T-al的菌液PCR鉴定
[0054] 根据蓝白斑筛选原理，挑取3个形状规则圆整的单个白色菌落，分别接种到5mL LB液体培养基中（含0. 1%氨苄青霉素)，37°C 200r/min培养IOh~12h后进行菌液PCR鉴 定。反应体系为：2 X Taq PCR MasterMixlOy L，上、下游引物（100 μ mol/L)各0· 2 μ L，菌液 模板DNA2. 0μ L，加灭菌CldH2O至20μ L。PCR扩增条件为：95°C预变性5min ;94°C变性45s， 55°〇退火608,721：延伸908,37个循环；721：延伸81^11。？〇?反应结束后，取5以1^?〇?扩增 产物加 1 μ L6X loading buffer，混合均匀后上样，150V恒压电泳。电泳结束后取出凝胶， 于成像系统Image Quant300 (美国GE公司）中观察结果。
[0055] 3. 5. 2重组质粒pMD18-T_al的酶切鉴定
[0056] 将经菌液PCR鉴定正确的重组质粒转化菌用T天根T生化科技（T北京T)有限公 司质粒小提试剂盒进行质粒提取。将小量提取后的质粒用内切酶BamH I及Hind III双酶 切，酶切体系如下：ddH206. 0 μ L，10XFD buffer2. 0 μ L，BamH I 和 Hind III各 I. 0 μ L，重组 质粒10 μ L，总体积20 μ L。将上述混合液置于37°C酶切反应lh，吸取5 μ L酶切产物，加入 1 μ L6 X loading buffer,进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0057] 结果如图2所示，重组质粒pMD18-T-al经BamH I和Hind III双酶切后进行琼 脂糖凝胶电泳，出现大小约为2692bp和1660bp两条带，与预测结果相符。图2中，Ml DL2000DNA分子质量标准；M2 :DL5000DNA分子质量标准；I :pMD18-T-al双酶切产物。
[0058] 3. 5. 3al基因核苷酸序列测定
[0059] 选取菌液PCR及酶切结果都为阳性的重组菌液，送上海英俊生物工程有限公司进 行序列测定。测序结果：实施例1的3. 1设计的引物扩增的猪附红细胞体al基因全长核苷 酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0060] 3. 6不同株猪附红细胞体al基因序列的比对与分析
[0061] 将获得的序列用 NCBI 在线 BLAST(http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi) 进行同源性搜索；用BioEdit软件(版本号7. 0. 9. 0)或DNAMN软件(版本号7. 0. 2. 176) 将测序结果与NCBI上公布的猪附红细胞体德国54/96分离株株al基因序列（登录号为 AM265536)进行比对分析。
[0062] 结果：共获得41条猪附红细胞体al基因序列，扩增片段长度1657bp，利用 BioEdit软件对序列进行Clustal W分析，剔除彼此间完全相同的序列34条，最终剩余7条 序列。与GenBank登录的猪附红细胞体德国54/96分离株al基因序列（登录号AM265536) 相比，总共有41处位点发生碱基变异，分别发生在核苷酸序列的第44、192、209、252、278、 279、294、296、338、368、369、440、458、504、524、533、632、645、663、668、683、770、812、863、 878、933、945、977、1007、1037、1074、1142、1235、1304、1364、1370、1463、1472、1553、1564和 1595位，其中第252位在所有分离株中都发生变异，由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶。第338、 1553、1564、1595位在多个分离株同时发生突变，且都是胸腺嘧啶突变为其它碱基（图3)。 而JD12、JD104两条序列在碱基第278、294和368位都是由鸟嘌呤突变为腺嘌呤。不同猪 附红细胞体分离株间al基因核苷酸序列的变异率在0. 1~2. 3%之间，不同分离株al基因 部分核苷酸序列比对结果见图3。
[0063] 实施例2猪源附红细胞体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
[0064] 1.引物和探针的设计
[0065] 将已获得且鉴定正确的41条猪附红细胞体al基因序列与NCBI公布的al基因 (登录号为AM265536)序列利用DNAMAN软件(版本号7. 0. 2. 176)进行多重序列比对分析， 选取几段相对保守的片段，设计并合成一对特异性引物及TaqMan探针，确保所设计的引物 及探针在NCBI上与其他物种病原体基因以及猪基因比对具有高度特异性。引物序列如下 :F:5'-GCTGGAAAGATTGCTGGACTAGA-3'（SEQ ID N0:4)，位于 1657bp al 基因核苷酸序列的 第 360-382 位，R:5' -CCTCCCCCTAGGTCAT AAACAAGTA-3'（SEQ ID NO :5)，位于 1657bp 序列 的第 460-484 位；探针序列如下：FAM-5' -CAGCTGCGCTAGCT-3' -TAM