同批次间的Ct值计算变异系数CV， 确定该方法是否具有重复性及稳定性。
[0088] 结果：重组质粒pMD18-T_al标准品（编号126-5)的7个10倍稀释液 (3. 48X IO8Copies/ μ L>3. 48X IO7Copies/ μ L>3. 48X IO6Copies/ μ L>3. 48X IO5Copies/ yL、3.48X 104copies/yL、3.48X 103copies/yL、3.48X 102copies/yL)各进行 4 次 TaqMan实时荧光定量PCR (其中批次内2次，批次间两次)，均获得了良好的扩增曲线 (图6)，图6中，A、B为两次批间重复性检测结果；A为第一次批内不同稀释度的检测 结果；B为第二次批内不同稀释度的检测结果。1~7:分别为3.48X 108c〇pies/yL、 3. 48 X IO7Copies/ μ L、3. 48 X IO6Copies/ μ L、3. 48 X IO5Copies/ μ L、3. 48 X IO4Copies/ μ L、3. 48 X IO3Copies/μ L、3. 48 X IO2Copies/μ L的扩增曲线。不同稀释度标准品进行4 次实时荧光定量PCR所对应的平均Ct值在14. 168~34. 067间，标准差（SD)在0. 046~ 0. 232之间，变异系数（CV)值在0. 19%~I. 64%之间（表2)，这些数值表明该方法误差小， 扩增效率稳定。
[0089] 表2基于al基因的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的4次重复实验结果
[0090]
[0091] 实施例6采用本发明建立的基于al基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法检测猪 源附红细胞体
[0092] 1.对猪附红细胞体的检测
[0093] 对猪附红细胞体阳性全血基因组DNA随机取样，采用实施例2设计的引物和探针 进行al基因的TaqMan实时荧光定量PCR反应。将荧光定量反应后产物进行琼脂糖凝胶电 泳，得到约125bp左右大小的目的条带（图7)。图7中，M :DNA分子质量标准GenRuler? Low Range ;1~11 :基于猪附红细胞体al基因的TaqMan实时荧光定量PCR扩增产物；N :阴性 对照。
[0094] 2.对小附红细胞体的检测
[0095] 选择3份经16S rRNA和RNase P RNA (rnpB)基因序列测定鉴定为小附红细胞体 感染的猪血液样品(编号分别为31-135、51-148、51-151)，提取基因组0嫩，进行&1基因的 TaqMan real-time PCR反应，结果均成功地获得了扩增曲线（图8)，该3份样品的平均Ct 值分别为：27. 91、28. 08 和 29. 90。
[0096] 实施例7田间样品的初步检测及与基于gl基因的TaqMan实时荧光定量PCR检测 结果的比较
[0097] 从上海市长宁某屠宰场、松江某屠宰场、嘉定某屠宰场分别随机采集育肥猪新鲜 血液440份，利用购自上海赛百盛基因技术有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒(树脂 型）提取血液基因组DNA，采用建立的基于gl基因的TaqMan实时荧光定量PCR进行检测。 所有样品同时采用基于al基因的TaqMan real-time PCR方法进行检测，比较两者检测方 法检测结果的异同。
[0098] 对经过gl基因的荧光定量PCR检测的440份猪血DNA重新运用基于al基因的 TaqMan实时荧光定量PCR方法进行检测，结果显示，在440份样品中，116份经基于gl基因 的荧光定量PCR检测为阳性的样品，基于al基因的荧光定量PCR检测结果也为阳性；在324 份经基于gl基因荧光定量PCR检测为阴性的样品，有103份经基于al基因荧光定量PCR检 测也为阳性，另外221份检测为阴性(表3)。两者的阳性符合率：116/219X 100 % = 52.97 %，阴性符合率：221/221 X 100 % = 100 %。
[0099] 表3基于al基因和基于gl基因的TaqMan实时荧光定量PCR田间样品检测比较
[0100]
[0101] 在经TaqMan荧光定量PCR检测为阳性的田间样品中，选取50份样品进行16S rRNA和rnpB基因扩增和序列测定，并进行系统发育分析，结果显示，有33份为猪附红细胞 体阳性样品，11份为小附红细胞体阳性样品，6份为上述两个种的混合感染。这些样品的成 功检测，表明本发明基于al基因的荧定量PCR不仅能检测出猪附红细胞体，也能检测小附 红细胞体。
[0102] 实施例8猪源附红细胞体实时荧光定量PCR检测试剂盒的组成及应用
[0103] 1、试剂盒的组成
[0104] 将探针、引物对、含有猪附红细胞体al基因的阳性重组质粒标准品、荧光定量PCR 反应缓冲液及聚合酶，装配成试剂盒，组装后置于-20°C保存。
[0105] 2、本发明试剂盒的应用
[0106] (1)无菌采集病猪血液样品440份，加入抗凝剂朽1檬酸葡萄糖（acid citrate dextrose, ACD)，血液与抗凝剂的比例为1:10,混匀，4°C保存。
[0107] (2)取500 μ L抗凝血，用全血基因组DNA提取试剂盒提取猪血液样品基因组DNA， 于-20°C保存。
[0108] (3)用本发明试剂盒进行荧光定量PCR检测，将扩增曲线与根据猪附红细胞体al 基因阳性质粒10倍梯度稀释所作的标准曲线进行比较、判定。结果：共检出猪附红细胞体 感染阳性样品219份，感染率为49. 77%。
[0109] 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范 围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： 针对SEQ ID NO: 1所示猪附红细胞体al基因序列设计的TaqMan探针，该探针与所述 猪附红细胞体al基因序列第45~191位、第360~532位、第534~631位、第684~811 位、第1038~1141位、第1143~1234位、第1236~1363位、或第1371~1462位的核苷 酸序列特异性结合； 针对SEQ ID NO: 1所示猪附红细胞体al基因序列设计的引物对，该引物对用于扩增所 述猪附红细胞体al基因序列第45~191位、第360~532位、第534~631位、第684~ 811位、第1038~1141位、第1143~1234位、第1236~1363位、或第1371~1462位的 核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述 探针与SEQ ID NO: 1序列第360~532位的核苷酸序列特异性结合；所述引物对用于扩增 SEQ ID NO: 1序列第360~532位的核苷酸序列。3. 根据权利要求2所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述 探针与SEQ ID NO: 1序列第360~484位的核苷酸序列特异性结合；所述引物对用于扩增 SEQ ID NO: 1序列第360~484位的核苷酸序列。4. 根据权利要求3所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述 探针的序列如SEQ ID NO: 6所示；所述引物对的序列如SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其 特征在于，所述试剂盒还包括：含有猪附红细胞体al基因的阳性重组质粒标准品。6. 根据权利要求5所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述 阳性重组质粒是将长度为1657bp的猪附红细胞体al基因片段插入pMDIS-T载体而制得。7. 根据权利要求1至4中任一项所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其 特征在于，所述试剂盒还包括：突光定量PCR反应缓冲液及聚合酶。8. 根据权利要求1至4中任一项所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其 特征在于，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有淬灭基团。9. 权利要求1所述的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒在制备诊断猪的附红细 胞体病的产品中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的TaqMan探针；针对SEQ ID NO:1所示猪附红细胞体a1基因序列设计的引物对。本发明基于a1基因的猪源附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，具有特异性强、灵敏性高、重复性好的特点，可快速、准确、高通量地检测出猪血样品中是否存在附红细胞体，可应用于猪的附红细胞体病的临床诊断、分子流行病学调查、疗效评估和猪场净化等方面，对于猪的附红细胞体病的早期快速诊断、防控和净化具有重要意义。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/06
【公开号】CN104975077
【申请号】CN201410150317
【发明人】陈兆国, 王向佩, 周鹏, 米荣升, 黄燕
【申请人】中国农业科学院上海兽医研究所
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月12日