简易、快速分离筛选好氧解油脂芽孢杆菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分解油脂领域，具体涉及一种简易、快速分离好氧解油脂芽孢杆菌的方法。
技术背景
[0002]宾馆、酒店等餐饮业的含油脂废水若未经处理直接排入城市生活污水处理装置.其中的油类物质包裹在填料外层令氧的传递受阻，导致好氧微生物代谢紊乱，影响处理效果，有可能使处理系统崩溃。有时油脂会在管道中凝聚，有可能就会发生堵塞，从而在厌氧的环境下厌氧菌分解产生气体，严重的就会发生爆炸，在美国就曾经发生过由于油脂堵塞生活污水管网而引起的爆炸事件。
[0003]据有关资料显示:一滴油流入水后可形成0.25m2的油膜。2000L油在10小时左右即可在水面扩展成2000m2、0.2nm厚的油膜。形成的油膜隔绝空气，阻碍了水体的复氧，阻隔了水体中氧的来源。同时，水体中的溶解油和乳化油在被水中好养微生物氧化分解过程中，也演耗水体中的溶解氧。上述两个因素的共同作用会使水体中的CO2浓度增高，pH值下降，致使水生生物丧失生存条件。另一方面，微生物在分解油类的过程中产生诸如长链脂肪酸等对水生生物也有毒害作用，从而使水体中的生态系统的平衡遭到破坏。
[0004]事实上油类物质对环境的影响是多方面的:对江河湖泊地表水的污染、对土壤及地下永豹污染等。在受污染地区，大批的鱼类和珍稀的动物因窒息或皮肤受油类污染而死亡。对生活在江河湖泊附近的居民来说.油对地表水的污染触目惊。油污染不仅影水体的水质，而且对工农业生产及日常生活用水都会造成影响，极少量的油就会使水不适于灌溉和牧畜饮用；在油污水体中所有的水生生物都会受影响；油类污染还降低水体的自净能力，影响水源沿岸的环境卫生；油类在土壤中向下迀移，就可能造成严重的地下水污染，使本来已经短缺的水资源雪上加霜，从而严重影响人类的生存环境。
[0005]含油脂废水的处理方法有物理法、化学法、物理化学及生物法。
[0006]生物法与物理或化学方法相比较具有成本低，投资小，效率高，无二次污染等特点。其基本机理是:微生物能利用油脂作为生长所需要的碳源和能源，在酶的催化作用下将油脂水解为甘油，脂肪酸，最后分解为H2OXO2等代谢产物，从而使废水得以净化。生物对氧的需求上可分为厌氧生物处理和好氧生物处理。好氧生物处理从过程形式上可分为活性污泥法、氧化塘法和生物膜法。
[0007]好氧物生物分解油脂是指利用好氧微生物分解油脂的一种方法，近些年来不断有好氧解油脂菌被分离出来(据有关资料显示细菌中产脂肪酶的有葡萄菌属、假单孢菌属、碱杆菌属、芽孢杆菌属等；真菌中产脂肪酶的有根霉属、曲霉属、地霉菌属；酵母菌中产脂肪酶的有假丝酵母、解脂耶氏酵母和红酵母等)，这就为油脂分解技术提供了一个新的途径。
[0008]芽孢杆菌属的特点:
1.细菌呈直杆状，细胞染色大多数在幼龄培养时呈G+，好氧或兼性厌氧，化能异氧菌，具有发酵或呼吸代谢类型；在条件不利的情况下形成芽孢，将自已保护起来，复活率高。其有耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压等，故以其开发产品有较高的稳定性。
[0009]2.菌体生长营养要求简单。
[0010]3.有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，对污染水体的有机物有较强的降解能力。
[0011]综上所述，亟待设计出一种简易、快速分离好氧解油脂芽孢杆菌的方法，以利于快速分离、提纯出高效好氧产脂肪酶的芽孢杆菌，以期为生物降解油脂作贡献。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是提供了一种简易、快速分离好氧解油脂芽孢杆菌的方法，筛选出具有好氧分解餐饮行业下水道与土壤油脂的芽孢杆菌。
[0013]本发明的目的通过以下技术方案实现:
简易、快速分离筛选好氧解油脂芽孢杆菌的方法，其特征在于:包括以下步骤:
(1)选择土壤、餐饮业下水道管壁泥样或活性污泥目标物接种于含有油脂的富集培养基中，5-37°C进行间歇增氧富集培养；
(2)移取富集培养物在75-80°C水浴杀除杂菌后，稀释涂布于含有BTB指示剂的油脂梯度平板上5-37°C培养2-7d ;其中，含有BTB指示剂的油脂梯度平板的制备方法是先在培养皿中倒空白LB琼脂倾斜平板，待其凝固后倒入经充分混匀油脂的BTB琼脂培养基；
(3)对培养后的平板挑选高梯度区域呈黄色菌落，继续用划线法获得纯培养物，对纯培养物革兰氏染色镜检，以内生芽孢杆菌作为初筛菌株；
(4)对初筛菌株利用LB液体培养基纯培养；
(5)取纯培养菌液滴加到处于不同油脂浓度的油脂平板中的灭菌滤纸片上，以无菌水滤纸片为对照，测定透明圈以求解其去除率，复筛出好氧解油脂能力强劲的芽孢杆菌。
[0014]所述的LB液体培养基配方如下:胰蛋白胨10.(^/1，氯化钠5.(^/1，酵母膏10g/L，水1000ml ;pH值为7.2 ;所述富集培养基为LB液体培养基中添加动物或植物油脂
10-2000mg/L ;所述BTB油脂琼脂培养基为富集培养基中添加0.06%BTB lml/L和琼脂15 —20g/L ;所述LB琼脂培养基为LB液体培养基的基础上加入琼脂15 — 20g/L ;所有培养基均需经过121°C，灭菌25_30min。
[0015]本发明的有益效果:
1、利用本发明的方法可简易、快速分离筛选好氧解油脂芽孢杆菌，具有培养基组成简单、营养全面、酵母中富含促生长因子、富集培养时间短等优点。
[0016]2、初筛中加入水浴环节能有效提高芽孢菌的检出率，大大降低在筛选目标菌株的工作量。应用定性与定量的方法相给合，使得工作效率更快。
[0017]3、培养基中添加BTB指示剂(指示范围pH6.0-7.6，黄一蓝)，当菌株有脂肪降解酶时，培养基中的油脂被分解为脂肪酸，所以菌落呈黄绿色，便于识别。
[0018]4、应用纯培养物的透明圈试验用滤纸片法较传统牛津杯法简易且可操作性强。
[0019]5、本方法不需过多的检测设备，一般条件的生化实验室均可实现解油脂菌的快速分尚与培养。
[0020]总之，本发明方法具有简易、快速、直观、高效分离具有好氧解油脂能力芽孢杆菌的的特点，为生物解油菌的分离提供了一个新的途径。
【具体实施方式】
[0021 ] 下面通过具体实施例来进一步说明。
[0022]实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围；此外应理解为:在阅读本发明所叙述之后，本领域的技术人员可能对本发明作各种改动与修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限制的范围。
[0023]实施例1
植物油加工榨坊周边，多点采集地面土壤(表层2-3cm弃去)500g,置于来过菌的纸袋中带回实验室混合均匀；取58接种于含有大豆油700mg/l的富集培养基500ml三角锥形瓶中，10°C条件下进行间歇增氧富集培养3d ;移取适量富集培养75-80°C水浴杀除杂菌后，稀释涂布于含大豆油脂的梯度平板(在无菌操作台中操作；先在培养皿中倒空白LB琼脂倾斜平板，待其凝固后倒入经充分混匀油脂的BTB琼脂培养基；注意在倒BTB油脂培养基前在培养皿底部用“一”标识油脂梯度增加方向)10°C培养培养2 - 3d ;挑取高油脂区域中黄绿色的菌落，继续用划线法在LB琼脂获得纯培养物，对纯培养物革兰氏和孔雀石绿染色镜检，以内生芽孢杆菌的G+性菌为初筛菌株；10°C条件下将初筛菌株用LB液体培养基进行间歇增氧纯培养，取纯培养菌液滴加到在200mg/l浓度大豆油脂的富集油脂平板中灭菌滤纸片上，以无菌水滤纸片为对照10°C培养2-3d，测定各纯培养物的降解油脂透明圈，以透明圈大者为优，复筛出好氧解油脂能力强劲的芽孢杆菌。
[0024]通过上述方法，分离到解大豆油脂芽孢杆菌3株，根据透明圈大小暂定名GZY01、GZY02 、GZY03。
[0025]实施例2
在餐馆下水道管壁，多点采集管壁附着污物500g，置于来过菌的纸袋中带回实验室混合均匀；取58接种于含有猪油200mg/l的富集培养基500ml三角锥形瓶中，30°C条件下进行间歇增氧富集培养2d ;移取适量富集培养物75-80°C水浴杀除杂菌后，稀释涂布于含大豆油脂的梯度平板(在无菌操作台中操作；先在培养皿中倒空白LB琼脂倾斜平板，待其凝固后倒入经充分混匀油脂的BTB琼脂培养基；注意在倒BTB油脂培养基前在培养皿底部用“一”标识油脂梯度增加方向)30°C培养培养2d ;挑取高油脂区域中黄绿色的菌落，继续用划线法在LB琼脂获得纯培养物，对纯培养物革兰氏和孔雀石绿染色镜检，以内生芽孢杆菌的G+性菌为初筛菌株；30°C条件下将初筛菌株用LB液体培养基进行间歇增氧纯培养，取纯培养菌液滴加到在200mg/l浓度猪油的富集油脂平板中灭菌滤纸片上，以无菌水滤纸片为对照，30°C培养2d，测定各纯培养物的降解油脂透明圈，以透明圈大者为优，复筛出好氧解油脂能力强劲的芽孢杆菌。
[0026]通过上述方法，分离到解动物油脂芽孢杆菌3株，根据透明圈大小暂定名GDY01、⑶ Y02o
【主权项】
1.简易、快速分离筛选好氧解油脂芽孢杆菌的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)选择土壤、餐饮业下水道管壁泥样或活性污泥目标物接种于含有油脂的富集培养基中，5-37°C进行间歇增氧富集培养； (2)移取富集培养物在75-80°C水浴杀除杂菌后，稀释涂布于含有BTB指示剂的油脂梯度平板上5-37°C培养2-7d ;其中，含有BTB指示剂的油脂梯度平板的制备方法是先在培养皿中倒空白LB琼脂倾斜平板，待其凝固后倒入经充分混匀油脂的BTB琼脂培养基； (3)对培养后的平板挑选高梯度区域呈黄色菌落，继续用划线法获得纯培养物，对纯培养物革兰氏染色镜检，以内生芽孢杆菌作为初筛菌株； (4)对初筛菌株利用LB液体培养基纯培养； (5)取纯培养菌液滴加到处于不同油脂浓度的油脂平板中的灭菌滤纸片上，以无菌水滤纸片为对照，测定透明圈以求解其去除率，复筛出好氧解油脂能力强劲的芽孢杆菌。2.根据权利要求1所述简易、快速分离筛选好氧解油脂芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述的LB液体培养基配方如下:胰蛋白胨10.0g/L，氯化钠5.0g/L,酵母膏10g/L，水1000ml ;pH值为7.2 ;所述富集培养基为LB液体培养基中添加动物或植物油脂10-2000mg/L ;所述BTB油脂琼脂培养基为富集培养基中添加0.06%BTB lml/L和琼脂15 — 20g/L ;所述LB琼脂培养基为LB液体培养基的基础上加入琼脂15 - 20g/L ;所有培养基均需经过121。。，灭菌 25-30min。
【专利摘要】本发明公开了一种分离解油脂芽孢杆菌的方法，对目标物取样进行间歇增氧选择性富集培养，然后对富集培养物进行水浴后，稀释涂布在含溴百里酚蓝（BTB）指示剂的油脂平板，利用解油菌能将动、植物油脂分解成脂肪酸而显黄绿色的特点，快速筛出好氧产脂肪解脂的菌株；通过划线法得到纯培养菌株，接着对纯培养物进行革兰氏、芽孢染色镜检，以初筛选出具有好氧分解油脂能力的芽孢杆菌；取纯培养菌液滴加到在不同油脂浓度的油脂平板中灭菌滤纸片上，以无菌水滤纸片为对照进行培养，根据透明圈大小快速复筛出高效解油脂的菌株。本发明方法具有快速分离、提纯出高效好氧解油脂的芽孢杆菌的特点。
【IPC分类】C12R1/07, C12N1/20, C12N1/02
【公开号】CN105002114
【申请号】CN201510440619
【发明人】周呈祥, 叶伟武, 同现鹏
【申请人】杭州银江环保科技有限公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月24日