0040]
[0041]
[0042] (一）从NPG小鼠囊胚建立多潜能干细胞系
[0043] 高度免疫缺陷小鼠来源及品系鉴定：
[0044] 本实施例选用的高度免疫缺陷小鼠品系是由北京维通达生物技术有限公司提供 的NPG小鼠。与国际公认的局度免疫缺陷小鼠品系NSG小鼠具有相似的基因突变及免疫缺 陷特征。检测结果见附图1。
[0045] 主要使用的试剂：
[0046]NPG小鼠多潜能干细胞培养基：knock-outDMEM+N2(100x)/B27(50x)，1 %双抗 (青霉素/链霉素），0.ImMP-琉基乙醇，ImM谷氨酷胺，1 %非必需氨基酸（Non-essential AminoAcids)，3yMCHIR99021，0.5yMPD0325901，VitaminC(50yg/ml)LIF(10ng/ml)。
[0047] 实验步骤：
[004引1)收集胚胎E3.5时期的NPG小鼠囊胚（由北京维通达生物技术有限公司提供）。
[0049] 2)将NPG小鼠囊胚接种于小鼠成纤维饲养层细胞上，在NPG多潜能干细胞培养基 (2i/LIF+VitaminC)中培养5-8天，其间每天更换新鲜培养基。
[0050] 3)将原代生长出来的克隆手工挑出并用膜酶或accutase消化成为单细胞， 传代接种于新鲜的小鼠成纤维饲养层细胞上，在NPG小鼠多潜能干细胞培养基（2i/ LIF+VitaminC)中进行培养及后续传代。传代周期为4-6天。
[0051] 4)挑选可W长期稳定传代的细胞系进行后续鉴定实验。
[0052](二）NPG小鼠多潜能干细胞系培养和传代
[0053] 主要使用的试剂：
[0054]NPG小鼠多潜能干细胞培养基：knock-outDMEM+N2(l〇〇x)/B27(50x)，1 %双抗 (青霉素/链霉素），0.ImMP-琉基乙醇，ImM谷氨酷胺，1 %非必需氨基酸（Non-essential AminoAcids)，3yMCHIR99021，0. 5yMPD0325901，VitaminC巧0yg/ml)，LIF(10ng/ml)。 [00财实验步骤：
[0056] 1)观察NPG小鼠多潜能干细胞克隆，待其长至对数期（3-5天）即可进行传代。
[0057]。吸出原10cm培养皿中的培养基，用PBS洗2遍，W除去上层死细胞。加入l-2ml accutase于37摄氏度消化1-3分钟。其间不断轻轻拍打晃动培养皿。
[005引 3)待NPG小鼠多潜能干细胞克隆开始散开且有约50 %W上的克隆从饲养层细胞 上脱落时，加入约2-3mlNPG小鼠多潜能干细胞培养基终止消化。
[0059] 4)用移液枪轻轻将未脱落的克隆从饲养层细胞上吹落，一并转移至15ml离屯、管 中。
[0060] 5)用移液枪轻轻吹打，使克隆成为单细胞。90化pm离屯、3分钟后弃上清，加入约 2-3mlNPG小鼠多潜能干细胞培养基清洗，900巧m离屯、3分钟。
[0061]6)将提前准备好的饲养层细胞用PBS洗一遍，换液为NPG小鼠多潜能干细胞培养 基。
[0062] 7)将NPG小鼠多潜能干细胞克隆悬液按适当密度接于饲养层细胞上并摇匀，置于 37摄氏度培养箱中进行培养。之后每天更换培养基至下次传代（3-5天后）或冻存。
[0063] 实验结果见图2-图3,图7,用NPG小鼠多潜能干细胞培养基建立的NPG小鼠多潜 能干细胞可W体外长期稳定维持。
[0064] (S)NPG小鼠多潜能干细胞常规鉴定方法
[0065] 1.碱性憐酸酶活性染色鉴定
[0066] 主要使用的试剂：
[0067] Alkaline Phosphatase Detection Kit
[006引 PBS缓冲液
[006引实验步骤：
[0070] 1)除去细胞培养基之后，用PBS洗3遍。
[0071] 2)按Kit使用说明操作。化ttp://www.millipore.com/catalogue/item/ SCR004#)
[0072] 2.细胞免疫巧光鉴定
[0073] 主要使用的试剂：
[0074]PBS缓冲液
[00巧]4 %多聚甲醒
[0076] 封闭液：PBS缓冲液中加入0. 2%TritonX100和终浓度为5%二抗血清
[0077] 抗体稀释液：PBS缓冲液+0. 1 %的BSA
[0078] DAPI溶液：1yg/ml [007引实验步骤：
[0080] 1)除去细胞培养基之后，用PBS洗3遍。
[0081] 2)用4%多聚甲醒进行固定。（室溫20分钟或4摄氏度过夜）
[008引 3)吸出多聚甲醒，用PBS缓冲液洗3遍，每遍5分钟。
[0083] 4)加入封闭液封闭。（室溫60分钟或4摄氏度过夜）
[0084]W吸出封闭液，用PBS缓冲液洗3遍，每遍5分钟。
[0085]6)加入一抗（0ct4 (Abeam),Nanog(R&D),Sox2(SantaCruz),SSEA-1(mi11ipore)) (按1 :50-l:200进行稀释）。（37摄氏度2小时或4摄氏度过夜）
[0086] 7)吸出一抗，用抗体稀释液洗洗3遍，每遍5分钟。
[0087]8)加入二抗（donkeyantirabbitrhodamine(SantaCruz),donkeyantigoat rhodamine(SantaCruz),goatantimouserhodamine(SantaCruz)。（按 1 :50-l:200 进 行稀释）。（于避光处37摄氏度2小时或4摄氏度过夜）
[0088] 9)吸出二抗，用抗体稀释液洗3遍，每遍5分钟。
[008引10)加入DAPI溶液染细胞核，于室溫染1-5分钟。
[0090] 11)吸出DAPI溶液，用抗体稀释液洗3遍，每遍5分钟。
[0091] 12)加入抗体稀释液，巧光显微镜下观察或于4摄氏度避光保存。
[009引 3.细胞总RNA提取
[0093] 主要使用的试剂：
[0094]Trizol试剂
[0095] 异丙醇
[0096] 氯仿
[0097]DEPC水
[0098] 75 %乙醇：DEPC水配制
[0099] 无水乙醇
[0100] 实验步骤：
[0101] 1)除去细胞培养基之后，用PBS洗3遍。
[0102] 2)加入与培养基等体积的Trizol试剂，室溫放置10分钟。将细胞裂解液转移至 1. 5ml罔屯、管中。
[0103] 3)加入氯仿（体积为Trizol的1/4)剧烈震荡约15秒。室溫放置2-3分钟。
[0104] 4)于4摄氏度离屯、10分钟，离屯、力为12000g。
[0105] 5)转移上清至新的1. 5ml离屯、管中，加入等体积的异丙醇，室溫放置10分钟。
[0106]6)于4摄氏度离屯、10分钟，离屯、力为12000g。
[0107] 7)弃去上清，加入75%乙醇0. 5ml洗1-2次
[0108] 8)于4摄氏度离屯、5分钟，离屯、力为7500邑。
[0109] 9)弃去上清，将离屯、管倒置于吸水纸上惊干乙醇。
[0110] 10)加入DEPC水10y1于37摄氏度溶解。
[0111] 4.RNA反转录为cDNA [011引主要使用的试剂：
[0113]cDNA反转录试剂盒A3500 (Promega)
[0114] 实验步骤：
[011引1)配置反应体系（20yD[0116]
[0117] 2)将此体系混合液在室溫放置10分钟，然后放入PCR仪，42摄氏度解育15分钟， 95摄氏度5分钟。
[0118] 3)反应终止后将得到的cDNA溶液测定浓度后置于-20摄氏度保存。
[0119] 5.细胞基因组DNA提取
[0120] 主要使用的试剂：
[0121] 细胞裂解液：100ml体系含蛋白酶KlOOyg/ml，0. 2 %SDS，20mM邸TA，10mM Tris，0.IM化Cl
[0122] 实验步骤：
[0123] 1)将细胞用膜酶消化后重悬于预冷PBS中。
[0124] 2)于4摄氏度离屯、10分钟收集细胞。离屯、力为1500巧m [01巧]3)加入细胞裂解液400y1，50摄氏度震荡1小时
[0126]4)待体系冷却到室溫后，加入1/10体积饱和化Cl，反复颠倒混匀约10分钟。
[0127] 5)将离屯、管置于冰上冷却约20-30分钟。
[0128] 6)于4摄氏度离屯、15分钟。离屯、力为4000g
[0129] 7)将上清转移至新的1. 5ml离屯、管中，加入等体积预冷的无水乙醇，混匀。
[0130] 8)将离屯、管置于冰上冷却约20分钟。
[01引]9)于4摄氏度离屯、15分钟。离屯、力为13000巧m
[0132] 10)吸出上清，于室溫通风干燥基因组DM沉淀。
[0133] 11)加入30-50ul无菌水进行过夜溶解。
[0134] 6.多聚酶链式反应（PCR)分析
[0135] 主要使用的试剂：
[0136] 2XEasyl'aqPCRSupermix(北京全式金生物技术有限公司）
[0137] 实验步骤：
[0138] 1)配置反应体系（200y1)
[0139]
[0142] 3)PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行检验
[0143] 7.实时定量多聚酶链式反应（RT-PCR分析）
[0144] 主要使用的试剂：
[014引 细胞裂解液：100ml体系含蛋白酶KlOOyg/ml，0. 2 %SDS，20mM邸TA，10mM Tris，0.IM化Cl
[0146] 实验步骤：
[0147]PCR在ABIPrism7300SequenceDetectionSystem上用PowerSY目R够Green PCRMasterMix(AppliedBiosystems)体系完成.数据分析义用delta-deltaCt法。
[014引8.崎胎瘤实验
[0149] 实验步骤：
[0150] 1)将欲进行崎胎瘤注射的祀细胞重悬于D/F12培养基中，按一块6cm培养皿的细 胞对应一个位点注射入N0D/SCID免疫缺陷小鼠（北京维通达生物技术有限公司）腹腔或 皮下。
[0151] 2)待移植部位出现明显崎胎瘤生成后将小鼠断颈处死。用解剖键和解剖綴分离取 出崎胎瘤。
[0152] 3)将崎胎瘤置于4%多聚甲醒中进行固定，石蜡包埋切片染色观察。
[0153] 9.NPG小鼠多潜能干细胞注入C57小鼠8细胞期或囊胚期胚胎嵌合实验
[0154] 实验步骤：
[0155] 7-10个NPG小鼠多潜能干细胞显微注射到C57小鼠（北京维通达生物技术有限公 司）8细胞胚胎中（交配后2. 5天（2.5化C)雌鼠中分离得到）或者NPG小鼠多潜能干细胞 显微注射到C57小鼠囊胚中（3. 5化C雌鼠中分离得到），培养一天后，囊胚或8细胞胚胎分 别移植到2. 5化C或0. 5化CCD-1假孕雌鼠体内（每个输卵管或子宫角内6-8个胚胎）令 其继续发育出生为嵌合小鼠。
[0156] 10.NPG小鼠多潜能干细胞NPG特征性基因突变型检测
[0157] 实验步骤：
[015引1)基因组DNA的准备
[0159] 见："（一）NPG小鼠多潜能干细胞常规鉴定方法"中"5.基因组DNA提取"