过检测细胞的增殖活性、NO释放水平及 细胞免疫因子的分泌水平来探讨紫锥菊多糖对巨噬细胞的体外免疫调控作用。
[0060] 2. 2. 2. 1对RAW264. 7细胞增殖的影响 购买的RAW264. 7细胞复苏，培养在50ml培养瓶中，等瓶底细胞密度达到80%左右时， 弃去原培养液，用4mL不含FBS含1%P/S的DMEM培养液漂洗一遍，弃去洗液，加入2mL胰酶 TE消化3-4min，在显微镜下看到细胞变圆，间隙增大时加入5mLDMEM完全培养液终止消 化，用吸管将细胞吹下来，移至离心管中，1200rpm，离心3min。加DMEM完全培养液，台盼 蓝染色，计数，调整成浓度为2X105/ml的细胞悬液。将以上细胞悬液铺于96孔板中，每孔 100yL，于37°C、5%C02培养箱培养12h，待细胞贴壁后，弃去上清，分别加入50、100、250、 500yg/mL的EPPS、EPPSI、EPPSII及EPPSIII，空白对照组为DMEM完全培养液，每组设 8个重复。于37°C、5%C02培养箱中继续培养24h，收集上清液于无菌离心管中（用于后期的 测定)，每孔加入加入50yL0. 5mg/mL的MTT，继续培养4h后，每孔加入DMS0150yL，培养 Ih后，在微孔板快速振荡器上振摇5min，使蓝紫色甲瓒结晶充分溶解，用酶标仪测定各孔 在570nm处的吸光度值。RAW264. 7的增殖能力以增值指数表示，按公式（5-2)计算： 细胞增殖指数=(实验组〇D57Qnni/空白对照组OD570nni)X100% (5-2) 2. 2. 2. 2对RAW264. 7细胞分泌NO的影响 按2. 2. 2. 1项下方法，将细胞上清收到无菌离心管后，按NO试剂盒说明书测定NO的含 量。
[0061] 2. 2. 2. 3对RAW264. 7细胞分泌细胞因子的影响 按2. 2. 2. 1项下方法，将细胞上清收到无菌离心管后，按ELISA试剂盒说明书测定IFN-y的含量。
[0062] 2. 2. 2. 4对RAW264. 7细胞外观形态的影响 按2. 2. 2.1项下方法处理细胞，观察不同浓度EPPS、EPPSI、EPPSII及EPPSIII对RAW264. 7外观形态的影响。
[0063] 2. 3实验结果与分析 2. 3. 1对NK细胞活性影响 不同浓度紫维菊多糖（Echinacea Purpurea Polysaccharide，EPPS)及其纯化所得组 分EPPSI、EPPSII、EPPSIII对离体小鼠NK细胞活性的影响见表2-3。
[0064] 表2-3不同浓度EPPS、EPPSI、EPPSII及EPPSIII对离体小鼠NK细胞活性的影响
由表2-3结果表明，EPPS、EPPSI、EPPSII、EPPSIII对小鼠NK细胞活性有促进作用，并 且有一定的量效关系。EPPS、EPPSIII在50-250yg/mL范围内随浓度的升高，促进作用减 小；EPPSI、EPPSII在50-250yg/mL范围内随浓度的升高，促进作用增大。
[0065] 2. 3. 2 对RAW264. 7 活性影响
[0066] 2. 3. 2. 1对RAW264. 7细胞增殖的影响 不同浓度紫维菊多糖（Echinacea Purpurea Polysaccharide，EPPS)及其纯化所得组 分EPPSI、EPPSII、EPPSIII对RAW264. 7细胞增殖的影响见图10。 图10结果表明，EPPS、EPPSI、EPPSII、EPPSIII对RAW264. 7细胞活性有促进作用。EPPS促进增殖的能力在浓度50-500yg/mL范围内先增大后降低，250yg/mL时促进作用最 大，EPPSI、EPPSII促进增殖的能力在浓度50-500yg/mL范围内呈减低的趋势、EPPSIII 促进增殖的能力在浓度50-500yg/mL范围内先增大后降低，100yg/mL时促进作用最大。
[0067] 2. 3. 2. 2对RAW264. 7细胞分泌NO的影响 EPPS、EPPSI、EPPSII及EPPSIII对RAW264. 7 细胞分泌NO的影响见表 2-5。
[0068]表 2-5 不同浓度EPPS、EPPSI、EPPSII及EPPSIII对RAW264. 7 细胞分泌NO的影 响
由图11可见，EPPS、EPPSI、EPPSII及EPPSIII能促进RAW264. 7对NO的释放，并在 50-250yg/mL范围内呈量效关系。
[0069]2. 3. 2. 3对RAW264. 7细胞分泌细胞因子的影响 EPPS、EPPSI、EPPSII及EPPSIII对RAW264. 7 细胞分泌IFN-y的影响分别见表 2-6。
[0070]表 2-6 不同浓度EPPS、EPPSI、EPPSII及EPPSIII对RAW264. 7 细胞分泌IFN-y 的影响
由图 11可见，EPPS、EPPSI、EPPSII及EPPSIII能促进RAW264. 7 对IFN-y的释放，并 在50-250yg/ml范围内呈量效关系。
[0071] 2. 2. 2. 4对RAW264. 7细胞外观形态的影响
[0072] 不同浓度EPPS、EPPSI、EPPSII及EPPSIII对RAW264. 7外观形态的影响见图11。 由图11可见，空白处理的细胞呈圆形4??3、￡??3 1、￡??3 11及￡??3 111处理的细胞 有变长的趋势，体积变大、变的不太规则。EPPS、EPPSI的影响较为明显。
[0073] 2. 4小结 本实验表明EPPS、EPPSI、EPPSII、EPPSIII对小鼠NK细胞活性有促进作用，并且有一 定的量效关系。EPPS、EPPSI、EPPSII、EPPSIII对RAW264. 7细胞增殖有明显的促进作用， 同时能增加RAW264. 7细胞对NO、IFN-y的分泌量。
[0074] 对比试验一 根据酶解温度、PH、酶用量、酶解时间对紫锥菊多糖的提取率影响。设计正交试验。试 验结果分析见表1和表2。
[0075]
根据试验结果，可知在紫锥菊多糖酶法提取过程中，4个因素对提取率的影响顺序为A酶解温度>D酶解时间>C酶用量>BpH。根据分析，即酶解温度为50°C，pH为3. 0,酶用 量为5%，酶解时间为60min。
[0076] 对比试验二
由表3可知，七个实施例组的紫锥菊多糖的提取过程都得到了较高的提取率。
[0077] 综上，本发明提取紫锥菊多糖，在缩短提取时间的同时，大大提高了紫锥菊多糖的 提取率，并且得到了溶解性较好的紫锥菊多糖，具有较好的活性成分。
[0078] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则 之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种酶提取紫锥菊多糖的方法，其特征在于，提取方法包括以下步骤： ① 药材预处理：将紫锥菊地上部分粉碎过40-60目筛；加入脱脂溶剂，脱脂后，将脱脂 溶剂于20-80°C条件下挥干，处理后的药材备用； ② 提取：称取步骤①处理得到的药材适量，加入药材15-25倍量的水，调pH为2-4， 预热至40 °C -60 °C后，加入药材0. 04-0. 06倍量的酶制剂，酶解时间50min-70min， 80°C -KKTC灭酶 10_20min，在 80°C -KKTC继续搅拌保温 l_2h ; ③ 浓缩：离心，将上清液旋蒸减压浓缩至生药量1 9-1. 5的浓缩液； ④ 醇沉：向浓缩液中加入3-4倍的无水乙醇，0-4°C条件下静置24-48小时； ⑤ 洗涤：将步骤④得到的醇沉液抽滤，得到的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗 涤； ⑥ 干燥：将沉淀物用1-2倍量的水复溶，在140°C _160°C的条件下喷雾干燥得到紫锥菊 多糖。2. 根据权利要求1所述的酶提取紫锥菊多糖的方法，其特征在于，所述脱脂溶剂为石 油醚。3. 根据权利要求1或2所述的酶提取紫锥菊多糖的方法，其特征在于，所述脱脂溶剂为 石油醚、1，2-环氧丙烷、乙醚的混合，其质量份数比为：1-2:0. 05-0. 1:0. 02-0. 08。4. 根据权利要求1至3任一项所述的酶提取紫锥菊多糖的方法，其特征在于，所述酶制 剂为果胶酶。5. 根据权利要求1至4任一项所述的酶提取紫锥菊多糖的方法，其特征在于，所述酶 制剂为纤维素酶、果胶酶、蜗牛酶、植酸酶的混合，其质量份数比为：〇. 5-1:1-2:0. 1-0. 5 : 0. 05~0, 1 〇6. 根据权利要求1至5任一项所述的酶提取紫锥菊多糖的方法，其特征在于，所述紫锥 菊药材来源于紫锥菊属植物紫锥菊，取自盛花期到花后期的地上部分。
【专利摘要】本发明公开了一种酶提取紫锥菊多糖的方法，将紫锥菊地上部分粉碎成适宜大小，脱脂，提取，加酶制剂酶解、灭酶、继续高温提取、离心、上清液进行旋转蒸发浓缩，醇沉，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，复溶后，喷干，得紫锥菊多糖。本发明的有益效果是：本制备方法，具有反应条件温和、提取时间短、提取率高等优点，并且重现性高，稳定，制备得到的紫锥菊多糖溶解性较好，外观均一、水溶性好，并且获得较好的活性组分，具有较好的免疫活性。
【IPC分类】C12P19/14, C12P19/04, A61P37/04
【公开号】CN105002230
【申请号】CN201510409628
【发明人】郝智慧, 杨芬芳, 黄婷婷, 赵莉
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月13日