一种甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法_2

文档序号:9300658阅读:来源:国知局
tion 1)中完成。操作流程如下:
[0035] SI L按照表2配制好反应体系混合液(除了 2 μ L DNA模板),分装于2ml灭菌离 心管中,每管大于0. 5ml,置于制冷保存的载物架中。
[0036] S12.将原态微生物油气与水合物勘探工作站(isMOST Station 2)提取和纯化的 带核酸样品的深孔板一起置于载物架中,作为DNA模板。
[0037] S13.执行原态微生物油气与水合物勘探工作站(isMOST Station 1)设定的程 序,将建立PCR反应体系所需的混合试剂和2 μ L DNA模板依次加入对应的、新的深孔板中, 即完成PCR反应体系的配置。
[0038] 后续步骤参照文献(邵明瑞等,2013,三种油气指示菌定量PCR方法的建立及其 在油气田土壤中的初步应用,生物技术通报,第4期,172-178)进行操作;实验结束后,用 LightCycler 480 Software 1.5. 0软件对实验结果进行分析,即可获得样品中甲烧氧化菌 的丰度。
[0039] 本发明的有益效果:
[0040] 基于本发明,可以获得以下有益效果:
[0041] (1)使气态烃氧化菌及其关联菌类的核酸提取与纯化步骤实现自动化;
[0042] 基于科学分析结合大量优化实验研究结果,建立气态烃氧化菌及其关联菌类核酸 的最佳提取和纯化流程,根据其最佳核酸提取和纯化流程,通过多通道准确移液、抗悬滴、 机械臂和软件控制等技术,实现土壤和/或沉积物中核酸提取和纯化步骤的自动化。
[0043] (2)使气态烃氧化菌及其关联菌类特异基因 PCR体系的配制实现自动化;
[0044] 通过多通道准确移液、抗悬滴、机械臂和软件控制等技术,精确控制完成气态烃氧 化菌及其关联菌类特异基因的荧光定量PCR体系所需的各试剂的准确用量,实现PCR体系 配制的自动化,减少手工操作时的人为因素造成的误差。
[0045] (3)进一步地,层流罩的设计保证核酸提取等操作步骤在洁净环境中运行,一方面 确保无外界污染的影响和检测结果的准确性,另一方面将可挥发的试剂进行回收,保证操 作人员的安全和实验室环境的整洁。
[0046] 总结来说,突出的有益效果在于:(1)解决了丰度很低、对油气与水合物具有指示 意义的、专性或兼性微生物复杂样品的丰度检测,数据可靠性高;(2)本发明基于对油气与 水合物具有指示意义的气态烃氧化菌的多种指标的检测,可很好地适用于在复杂多样的勘 探区进行油气与水合物勘探;(3)样品的处理效率非常高,周期短,成本降;(4)自动化处 理,消除了多种影响因素,减少数据波动,有效避免在分析测定流程中引入的人为误差;(5) 整个检测流程通过计算机软件控制,检测流程可以追溯,可实现系统误差的统一校正。
【附图说明】
[0047] 图1本发明机械臂的结构示意图。
[0048] 图2本发明的移液原理图。
[0049] 图3本发明所述移液通道上设置的移液模块实物图。
[0050] 图4用本发明分析方法检测海洋沉积物平行样中细菌的PCR扩增电泳图。
[0051] 图5手工处理陆地土壤样品中细菌的PCR扩增的电泳图,其中a:CTAB_酚氯仿法; b:试剂盒法。
[0052] 1-机械臂,2-移液通道,3-移板机械手,4-纳升点样及96或384通道,5-活塞, 6-套筒,7-压力传感器,8-空气柱,9-液体。
【具体实施方式】
[0053] 下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。本发明装置和系统中最大的发明 点在于优化和整合了现有常规的其他领域的相关技术,解决了在进行微生物油气与水合物 勘探的样品分析检测时手工操作所存在的弊端。一些部件以及部件之间的连接关系可以参 照相关领域成熟的技术予以实现,因此并不在此一一赘述,或者因此限定本发明范围。
[0054] 实施例1
[0055] 本实施例提供一种原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化样品处理装置,包 括自动液体处理装置和核酸纯化设备;
[0056] 所述自动液体处理装置对样品、反应试剂的自动化加样、配制和处理,并通过整合 各种终端分析检测设备将整个实验过程置于无人操作的环境下全自动运行并给出结果。优 选地,所述自动液体处理装置由四个部分的结构组成:操作平台、机械臂、移液通道及实验 用品的载架和辅助设备;所述操作平台上设置有若干定位轨道(T),用于固定放置各种实 验用品的载架。操作平台是整个工作站的框架,为半封闭式结构,平台正面有可手工开、关 的气动控制门。平台上设计有很多定位轨道,不同的实验用品,不同的排放顺序,其所需要 的载架大小也不同,会占据不同数量T的位置。按处理样品的能力大小可将操作平台分为 多种类型。主要类型有三种:紧凑型操作平台:30个T,最多可放置25个SBS国际标准板 (如96孔微孔板);通用型操作平台:54个T,最多可放置45个SBS国际标准板(如96孔 微孔板);延展型操作平台:71个T,最多可放置55个SBS国际标准板(如96孔微孔板)。
[0057] 所述机械臂的结构示意图见附图1所示,机械臂1上装载移液工具和移板机械手 3,所述移液工具包括单个或多个独立控制的移液通道,所述机械臂1带动移液通道2在X 轴方向精确移动;移液通道2上设置若干移液模块以及纳升级的微量点样模块4。附图3提 供了一种移液模块的实物图。
[0058] 优选地,所述机械臂1上的每个移液通道2都具有独立的动态定位系统,多通道同 时操作时,每个通道可以同时在Y、Z轴进行非统一、非对称的移动和移液,通道间距离可以 调整,满足各种规格的样品管或多孔板的多道同时操作。通道可直接自动装卸一次性吸头 或可重复使用的针式吸头。
[0059] 可选地,所述机械臂可以为2~6个,不同机械臂同时执行不同的移液任务。
[0060] 进一步地,机械臂带动移液通道在X轴方向精确移动,将吸头精确定位。机械臂的 位移精度为±0. 1mm。机械臂上可装载各种移液工具,如单个或多个独立控制的移液通道, 并可提供1、2、4、8、12或16个移液通道的不同配置;对于更高通量,还可设置96通道或384 通道的移液模块,以及纳升级的微量点样模块。在装载有移液通道的机械臂上还可同时安 装移板机械手,而不需要额外的机械臂来控制。
[0061] 所述液体处理装置的移液技术是基于空气置换原理,类似于通常使用的手动移液 器,通过通道内活塞5的移动来推动空气进行吸液和放液的。采用这种原理移液不需要步 进电机控制的注射栗、各种导管和系统溶液,不易产生工作站内部的系统污染,避免了样品 间由于系统污染而产生的交叉污染。见附图2所示,附图2中,5为活塞,6为套筒,7为压力 传感器,8为空气柱,9为液体。
[0062] 所述辅助设备包括样品振荡装置、孵育装置、样品装载装置、样品编号扫描和记录 装置、实验耗材的转移装置、上下游设备的衔接装置。基于所述辅助设备的除了能够执行移 液操作以外,还能够执行很多其他的实验任务,如样品的振荡、孵育、自动装载和记录带编 号的样品、实验耗材的转移、与上下游实验设备的衔接等功能。
[0063] 所述核酸提取与纯化设备为全自动核酸磁珠提取与纯化系统,工作原理是先通过 震荡样品,使核酸游离出来,再用大体积提取磁头将样品中的核酸吸住,转移至新的离心管 中;这样重复操作3次,就可获得很纯的核酸,为后续开展PCR反应体系的自动化配置和实 时荧光定量PCR检测及其他分子生物学研究提供高纯度的核酸样品。在样品处理过程中, 不仅获得的核酸纯度高,而且其提取效率也非常高(对于微生物丰度很低的海洋沉积物样 品,仍然可以获得足量的核酸供后续工作之用)。采用现有常规计算机技术,在所述核酸提 取设备中内置多个核酸纯化程序,通过电脑软件控制而实现自动化操作。
[0064] 实施例2
[0065] 基于本发明所述原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化样品处
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