理装置，本实 施例提供一种原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站，所述工作站包括原态微 生物油气与水合物勘探技术的自动化处理样品装置，还包括层流罩和PCR反应体系配置系 统。
[0066] 在所述自动液体处理装置和/或核酸提取设备的上方设置超净层流罩，保证无菌 工作环境；也可连接通风管路，将实验中产生的有害物质排放或回收。这样的设置既能保护 操作者的健康与安全，也能保证样本与实验流程的安全性。
[0067] 基于本发明自动化装置和工作站，可以实现对气态烃氧化菌及其关联菌类丰度的 自动化分析，包括以下步骤：
[0068] SI.搭建工作平台，工作平台上设置定位轨道，用于固定放置各种实验用品的载 架；
[0069] S2.在自动液体处理与PCR反应体系配置系统（isMOST Station-Ι)及核酸提取设 备（isMOST Station-2)中，将样品的上清从样品管经自动进样系统分装到样品深孔板并在 样品深孔板中加入磁珠和缓冲液，同时将洗涤液和洗脱液分装于洗涤液深孔板；
[0070] S3.将装有上清的深孔板和装有洗涤液的深孔板分别安放于自动液体处理装置的 载架盘上；
[0071] S4.在核酸提取设备中，完成核酸的提取与纯化；
[0072] 具体是通过移液通道从试剂槽向样品深孔板和洗涤液深孔板中分别添加样品液 或核酸提取与纯化所需试剂，通过移液装置将添加样品液或所述试剂的洗涤液深孔板移动 至吸磁位置，经电磁头探入深孔板搅拌并吸住磁珠进行吸磁和抽吸废液，完成DNA洗脱；
[0073] S5.在PCR反应体系配置系统中进行PCR反应；
[0074] S6.获得PCR反应结果。
[0075] 其中，S2步骤所述样品为多个，分装于多个样品管中，连续自动进样，对样品管或 深孔板逐个扫描条形码，记录样品编号，实现样品跟踪，简化实验操作，并保证实验者的安 全。
[0076] 实施例3应用实验
[0077] 用原态微生物油气与水合物勘探技术（isMOST)工作站自动化提取与纯化土壤和 /或沉积物中核酸并结合实时荧光定量PCR仪开展甲烷氧化菌丰度测定。
[0078] 土壤和/或沉积物样品中甲烷氧化菌的总基因组DNA提取和总菌数量的分析方法 和具体实验步骤如下：
[0079] 一、配制试剂
[0080] 1、Buffer TE : IOmM Tris-HCl，ImM 的 EDTA，调 pH 为 8. 0 ;
[0081] 2、20mg/ml溶菌酶溶液配制：20mg溶菌酶溶解于Iml Buffer TE ;
[0082] 3、DNA 抽提液：10mM Tris-Hcl，IM EDTA，0· 5% SDS ;
[0083] 4、20mg/ml 蛋白酶 K ;
[0084] 5、Binding Buffer :从 Omega 公司购买；
[0085] 6、Buffer PHB :从 Omega 公司购买；
[0086] 7、SPM Wash Buffer :78 %体积比的乙醇水溶液（现配现用）。
[0087] 8、磁珠悬浮液（Magpure particles):每毫升磁珠悬浮液中包含被薄层纳米娃包 裹的磁性微球（直径是60nm)(奥润微纳新材料科技有限公司）50ng，其余为水。
[0088] 二、样品处理
[0089] 1、从干燥、碾细的土壤和/或沉积物样品中称取2. 5g，将其置于IOml灭菌离心管 中。
[0090] 2、向离心管中加入I. 5ml溶菌酶溶液（20mg/ml)，振荡悬浮，50°C水浴1小时；
[0091] 3、依次加入400 μ I DNA抽提液，25 μ 1蛋白酶K溶液（20mg/ml)，于55°C水浴中放 置2h。
[0092] 4、6000Xg离心5min，得到上清液；将上清液装于新的IOml灭菌离心管中，再次 6000 X g离心5min，每个样品得到大于I. 5ml的上清液。
[0093] 三、用本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站（isMOST Station 1)完成移液
[0094] 1、将IOml离心管放置在载物架中。
[0095] 2、按下表1将试剂准备好。
[0096] 3、执行原态微生物油气与水合物勘探工作站（isMOST Station 1)设定的程序，将 不同的试剂通过自动控制机械臂上移液通道和移液模块的操作自动加入对应的样品板、结 合板、洗涤板和洗脱板中。
[0097] 表1 :试剂清单
[0098]
[0099]
[0100] 四、自动核酸提取设备提取与纯化DNA
[0101] 将所有的样品板都准备好后，执行本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站 (isMOST Station 2)设定的程序，即可得土壤和/或沉积物中的总基因组DNA。约1小时 后，核酸提取与纯化流程结束，将样品的核酸提取液移转移至微量PCR管中，标记清楚后 于-20°C冰箱中保存。
[0102] 五、琼脂糖电泳检测
[0103] 1.取5 μ I DNA提取液于1 %琼脂糖上电泳鉴定，DNA Ladder为DL2000。
[0104] 2.若有>2kbp条带，则取5 μ I DNA提取液加灭菌水稀释20倍后作为PCR模板并 在4°C下保存，样品基因组DNA提取液保存于-20°C。
[0105] 六、核酸浓度和纯度检测
[0106] 对提取的样品基因组DNA使用微量核酸测定仪测定其浓度和纯度。当0D260 = 1 时，双链DNA (dsDNA)浓度约为50 μ g/ml
[0107] 单链 DNA (ssDNA)浓度约为 37 μ g/ml
[0108] 寡核苷酸浓度约为30 μ g/ml
[0109] 纯0嫩：00260/00280~1.8(若大于1.9，表明有1?熟污染；若小于1.6，表明有蛋 白质和酚等污染）。
[0110] 七、甲烷氧化菌数量的荧光定量PCR检测
[0111] ⑴甲烷氧化菌的培养
[0112] 配制甲烷氧化菌的培养基；将1 %甲烷氧化菌接种于培养瓶中；密封后注入甲烷/ 丁烷；在适宜的温度下培养15天，尔后转接培养，至肉眼可见培养液浑浊；收集培养所得的 甲烷氧化菌菌体，用于甲烷氧化菌的核酸提取及标准曲线的绘制。
[0113] (2)设计特异性引物
[0114] 根据甲烷氧化菌pmoA基因的CDS序列，设计并合成可用于荧光定量PCR检测甲烷 氧化菌的特异性引物。
[0115] 以甲烷氧化菌的特异性引物为例，根据甲烷单加氧酶基因的CDS序列，设计如下 可用于荧光定量PCR的引物，并由上海生工合成。引物序列如下：
[0116] F: 5，-CTGGCAGGGCATTCAGGATT-3 '
[0117] S: 5 ' -GAAGAAGGGCGTCAGCGTGT-3 '
[0118] (3)制备标准品
[0119] 以总基因组DNA为模板，采用特异性引物扩增甲烷氧化菌的目标片段，且将其与 T载体连接；将连接产物加至感受态细胞悬液中，再提取质粒；经测序证实为甲烷氧化菌目 标片段后，再测定质粒DNA的纯度并定量；最后用无菌双蒸水稀释至一定浓度，-20Γ分装 保存，作为荧光定量PCR的标准品。
[0120] (4)建立荧光定量PCR的反应体系和反应条件
[0121] 实时焚光定量 PCR 扩增在 Roche Light Cycler 480 (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)中完成。反应体系是根据 SYBRiC Premix Ex Taq?(TaKaRa)制造商说明书制备。用特异引物扩增甲烷氧化菌pm